激光共聚焦顯微鏡技術(shù)課件

1、生物醫(yī)學(xué)常用研究技術(shù)課程簡(jiǎn)介生物醫(yī)學(xué)常用研究技術(shù)課程簡(jiǎn)介研究方法的重要性現(xiàn)代科學(xué)研究以實(shí)證為基礎(chǔ)認(rèn)識(shí)了解研究對(duì)象的工具揭示研究對(duì)象變化和相互關(guān)系的手段每項(xiàng)新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)都蘊(yùn)涵尖端的科學(xué)理論和學(xué)術(shù)進(jìn)步諾貝爾獎(jiǎng)很大一部分授予了分析技術(shù)重大貢獻(xiàn)者。重視和熟悉實(shí)驗(yàn)技術(shù)是科研工作必備的條件。熟悉實(shí)驗(yàn)儀器和技術(shù)將促使做出創(chuàng)造性的工作“動(dòng)口不動(dòng)手”的“君子”是不可能在科學(xué)上做出重大成績(jī)的。研究方法的重要性現(xiàn)代科學(xué)研究以實(shí)證為基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)常用研究方法形態(tài)觀察分析方法顯微觀察技術(shù)：光學(xué)顯微鏡（正置，倒置，體視，熒光，偏光，金相，激光共聚焦），電子顯微鏡（TEM， SEM，ESEM），掃描探針顯微鏡（SPM），顯微

2、X斷層掃描儀（-CT）等形態(tài)測(cè)量與分析：各種分析測(cè)量軟件生物醫(yī)學(xué)常用研究方法形態(tài)觀察分析方法物理性質(zhì)分析方法硬度分析顆度分析機(jī)械性能測(cè)定與分析色彩分析物理性質(zhì)分析方法硬度分析化學(xué)性質(zhì)分析方法元素分析基團(tuán)分析晶體分析分子結(jié)構(gòu)測(cè)量電位測(cè)量化學(xué)性質(zhì)分析方法元素分析分子生物學(xué)方法 組織勻漿制備DNA分離與提取PCR技術(shù)分子雜交與質(zhì)粒構(gòu)建雙向電泳技術(shù)DNA，蛋白質(zhì)測(cè)序分子生物學(xué)方法 組織勻漿制備細(xì)胞生物學(xué)方法細(xì)胞培養(yǎng)與觀察流式細(xì)胞技術(shù)顯微注射技術(shù)細(xì)胞活力分析細(xì)胞生物學(xué)方法細(xì)胞培養(yǎng)與觀察微生物學(xué)方法普通與厭氧培養(yǎng)技術(shù)微生物鑒定技術(shù)染色技術(shù)菌落計(jì)數(shù)儀螺旋接種儀微生物自動(dòng)鑒定儀微生物學(xué)方法普通與厭氧培養(yǎng)技術(shù)樣

3、本制備方法樣本固定脫水、包埋組織切片技術(shù)染色技術(shù)其它樣本制備方法樣本固定目的通過(guò)講課和見(jiàn)習(xí)，希望能達(dá)到以下目的： 了解主要的生物醫(yī)學(xué)常用研究方法 了解各種研究方法的原理和使用目的 能根據(jù)研究目標(biāo)選擇正確的研究方法目的通過(guò)講課和見(jiàn)習(xí)，希望能達(dá)到以下目的：重要性掌握常用生物醫(yī)學(xué)常用研究方法與技術(shù)，對(duì)在今后科學(xué)研究工作中作出高水平的創(chuàng)造性成果將會(huì)起到重要的作用。重要性掌握常用生物醫(yī)學(xué)常用研究方法與技術(shù)，對(duì)在今后科學(xué)研究工激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室觀察目標(biāo)尺寸觀察目標(biāo)尺寸分辨率分辨率電子顯微鏡的缺點(diǎn)由于樣品需要固定,觀測(cè)活細(xì)胞十

4、分困難.樣品制備過(guò)程（固定、包埋、切片）造成的假象只能觀察標(biāo)本超微形態(tài)和結(jié)構(gòu),無(wú)法對(duì)生理活動(dòng)進(jìn)行觀察電子顯微鏡的缺點(diǎn)由于樣品需要固定,觀測(cè)活細(xì)胞十分困難.熒光顯微鏡的缺點(diǎn)無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光,透射光的同時(shí)采集,無(wú)法實(shí)現(xiàn)多熒光的同時(shí)采集熒光散射光太強(qiáng)，造成實(shí)際分辨率大大下降。熒光漂白很快，使熒光圖像的拍照有困難。無(wú)法對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描,完成3維重建工作.對(duì)于信號(hào)較弱的樣本,無(wú)法提高觀察的靈敏度.可以觀查活細(xì)胞或組織但細(xì)胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊熒光顯微鏡的缺點(diǎn)無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光,透射光的同時(shí)采集,無(wú)法實(shí)現(xiàn)多激光光譜Red:HeNe 633nm，Orange:HeNe 594nm，Green: HeNe 543

5、nm，Blue: Ar 458nm; 476nm; 488nm 496nm, 514nm，Purple: Diode: 405 nm激光光譜Red:HeNe 633nm，Orange:HeNe偽彩色的概念偽彩色的概念共聚焦顯微鏡的原理 光學(xué)原理SampleLaserPrismPMTAOBS共聚焦顯微鏡的原理 光學(xué)原理SampleLaserPrisFluorescent MicroscopeArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOcularExcitation FilterObjectiveLaserPinholeExcitation Pinhol

6、ePMTExcitation FilterConfocal MicroscopeFluorescent MicroscopeArc Lamp掃描成像原理掃描成像原理三維重建原理三維重建原理棱鏡分光技術(shù)棱鏡分光技術(shù)光譜掃描技術(shù)適用于所有染料，發(fā)射光譜位置及寬度可任意調(diào)節(jié)適合對(duì)自發(fā)熒光進(jìn)行檢測(cè)最大程度降低對(duì)樣品的光損害同時(shí)檢測(cè)5個(gè)真正的共聚焦通道直觀的操作界面光譜掃描技術(shù)適用于所有染料，發(fā)射光譜位置及寬度可任意調(diào)節(jié)激光掃描頭結(jié)構(gòu)激光掃描頭結(jié)構(gòu)激光掃描共聚焦顯微鏡 構(gòu)成顯微鏡掃描頭激光器電腦激光器電 腦掃描頭顯微鏡電腦顯示屏激光掃描共聚焦顯微鏡 構(gòu)成顯微鏡激光器電 腦掃描頭顯微鏡電激光掃描共聚焦顯微

7、鏡 特點(diǎn)激光掃描共聚焦顯微鏡 特點(diǎn)激光掃描共聚焦顯微鏡 優(yōu)點(diǎn)排除焦點(diǎn)外光信號(hào)干擾激光掃描共聚焦顯微鏡 優(yōu)點(diǎn)排除焦點(diǎn)外光信號(hào)干擾提高分辨率提高分辨率改善視野廣度和深度改善視野廣度和深度多重染色與適時(shí)多通道掃描多重染色與適時(shí)多通道掃描一維到四維觀察一維到四維觀察靜態(tài)和動(dòng)態(tài)觀察靜態(tài)和動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞分子變化觀察活細(xì)胞分子變化觀察定性定量定位分析定性定量定位分析激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用光學(xué)切片觀察(細(xì)胞CT):激光掃描共聚焦顯微鏡可對(duì)活的或固定的細(xì)胞及組織進(jìn)行無(wú)損傷的系列光學(xué)切片。這一功能又被簡(jiǎn)稱為“細(xì)胞CT”。激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用光學(xué)切片觀察(細(xì)胞CT):影像三維重建通過(guò)薄層光學(xué)切片功能，可獲

8、得標(biāo)本真正意義上的三維數(shù)據(jù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理及三維重建軟件，可產(chǎn)生生動(dòng)逼真的三維效果，從而能靈活、直觀地進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。影像三維重建通過(guò)薄層光學(xué)切片功能，可獲得標(biāo)本真正意義上的三維影像三維重建影像三維重建影像三維重建影像三維重建影像三維重建影像三維重建熒光的定量定位分析激光掃描共聚焦顯微鏡可對(duì)單、雙或三標(biāo)的細(xì)胞及組織標(biāo)本的熒光進(jìn)行定量、定位分析，也非常適合于高靈敏度的快速免疫熒光測(cè)定，可以準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)抗原表達(dá)、熒光原位雜交及細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特性并進(jìn)行定量分析。熒光的定量定位分析激光掃描共聚焦顯微鏡可對(duì)單、雙或三標(biāo)的細(xì)胞細(xì)胞物理化學(xué)測(cè)定激光掃描共聚焦顯微鏡可對(duì)細(xì)胞周長(zhǎng)、面積、

9、平均熒光強(qiáng)度等參數(shù)進(jìn)行測(cè)。能對(duì)細(xì)胞的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨、結(jié)構(gòu)性蛋白,DNA,RNA,酶和受體分子等細(xì)胞內(nèi)特異結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進(jìn)行定量、定性、定時(shí)及定位測(cè)定。細(xì)胞物理化學(xué)測(cè)定激光掃描共聚焦顯微鏡可對(duì)細(xì)胞周長(zhǎng)、面積、平均細(xì)胞理化測(cè)定細(xì)胞理化測(cè)定pH、細(xì)胞內(nèi)離子分析利用熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡可對(duì)細(xì)胞內(nèi)各種離子的含量及動(dòng)態(tài)變化作毫秒級(jí)定時(shí)定量分析，較多的是對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及濃度變化的測(cè)量。利用BCECF等探針可對(duì)細(xì)胞內(nèi)pH進(jìn)行測(cè)定。也就是說(shuō)利用激光掃描共聚焦顯微鏡能進(jìn)行細(xì)胞生理信號(hào)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。pH、細(xì)胞內(nèi)離子分析利用熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡可對(duì)細(xì)熒光漂白恢復(fù)(FRAP

10、) 技術(shù)借助于高強(qiáng)度脈沖式激光照射細(xì)胞的某一區(qū)域，從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅，該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子將以一定速率向受照區(qū)域擴(kuò)散，用激光掃描共聚焦顯微鏡可直接對(duì)此擴(kuò)散速率進(jìn)行檢測(cè)，由此可以研究細(xì)胞骨架構(gòu)成、核膜結(jié)構(gòu)和大分子自組裝等。熒光漂白恢復(fù)(FRAP) 技術(shù)借助于高強(qiáng)度脈沖式激光照射細(xì)胞FRAP技術(shù)FRAP技術(shù)FRAP技術(shù)FRAP技術(shù)FRAP技術(shù)FRAP技術(shù)細(xì)胞間通訊研究多細(xì)胞生物體中，細(xì)胞間相互影響和控制的生物學(xué)過(guò)程稱為細(xì)胞間通訊，它被認(rèn)為在細(xì)胞增殖和分化中起著非常重要的作用，激光掃描共聚焦顯微鏡可測(cè)量傳遞細(xì)胞調(diào)控信息的離子及分子。細(xì)胞間通訊研究多細(xì)胞生物體中，細(xì)胞間相互影響和控制

11、的生物學(xué)過(guò)細(xì)胞間通訊研究Recovery of fluorescence10 seconds30 secondsZero timeTimeIntense laser BeamBleaches Fluorescence細(xì)胞間通訊研究Recovery of fluorescenc熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）能量轉(zhuǎn)移是能量從分子的一個(gè)部位向另一個(gè)部位的傳遞，或能量從一個(gè)分子向另一個(gè)分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件兩個(gè)熒光分子：供體-FL1，受體-FL2供體與受體的距離在2-7nm供體的發(fā)射波長(zhǎng)與受體的激發(fā)波長(zhǎng)一致熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）能量轉(zhuǎn)移是能

12、量從分子的一個(gè)部位向熒光能量共振轉(zhuǎn)移以FL1的激發(fā)波長(zhǎng)的光照射樣品，沒(méi)有共振轉(zhuǎn)移時(shí)，只檢測(cè)到 FL1的發(fā)射光(綠光)，發(fā)生共振轉(zhuǎn)移時(shí)，就可檢測(cè)出FL1的熒光(綠光)減弱，F(xiàn)L2(紅光)的增強(qiáng)。DAr 2R0Dr 2R0A熒光能量共振轉(zhuǎn)移以FL1的激發(fā)波長(zhǎng)的光照射樣品，沒(méi)有共振轉(zhuǎn)移熒光能量共振轉(zhuǎn)移生物大分子結(jié)構(gòu)和功能研究蛋白質(zhì)間相互作用研究,如蛋白分子構(gòu)象改變、大分子(亞基)的結(jié)合與分離、受體與配體的結(jié)合等核酸的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型、核酸雜交分析脂質(zhì)的分布和傳輸、膜電位傳感和膜融合分析自動(dòng)DNA測(cè)序熒光能量共振轉(zhuǎn)移生物大分子結(jié)構(gòu)和功能研究熒光染料熒光染料是能吸收光并能在較短時(shí)間內(nèi)發(fā)射熒光的分子通常具有芳香

13、環(huán)結(jié)構(gòu).熒光染料熒光染料是能吸收光并能在較短時(shí)間內(nèi)發(fā)射熒光的分子通常熒光染料的選擇研究目的可選探針?lè)秶玖系男再|(zhì)激光熒光染料的選擇熒光染料的性質(zhì)光譜特性良好熒光壽命長(zhǎng)且穩(wěn)定量子產(chǎn)率高分子小，易于與生物分子結(jié)合不影響被結(jié)合生物分子的結(jié)構(gòu)和特性多重?zé)晒庵g盡量不發(fā)生相互影響熒光染料的性質(zhì)光譜特性良好檢測(cè)核酸共聚焦顯微鏡可定位、定性及定量檢測(cè)核酸。常用于細(xì)胞核定位及其形態(tài)學(xué)觀察、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA狀況及染色體定位觀察等。常用探針： PI (碘化丙啶)、Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI(4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)檢測(cè)核酸共聚焦顯微鏡可定位、定性及定量檢測(cè)核酸。常用于細(xì)胞

14、核檢測(cè)蛋白質(zhì)、抗原或受體染料可與抗體、配體、肽、人工合成的寡核苷酸等耦聯(lián)。可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記，檢測(cè)細(xì)胞表面抗原、胞內(nèi)蛋白，細(xì)胞膜表面受體等。常用探針：FITC (異硫氰酸熒光素)、TRITC (四甲基異 硫氰酸羅丹明)、XRITC (異硫氰酸羅丹明X)、Texas Red (德州紅)、PE (藻紅蛋白)、Cy5檢測(cè)蛋白質(zhì)、抗原或受體染料可與抗體、配體、肽、人工合成的寡核檢測(cè)細(xì)胞器部分探針可直接進(jìn)入死細(xì)胞(包括固定細(xì)胞) 或活細(xì)胞的胞膜，選擇性地與特定細(xì)胞器結(jié)合。此外，利用免疫熒光技術(shù)可以標(biāo)記細(xì)胞中任何細(xì)胞器。常用探針：線粒體：JC-1、Rhodamine 123溶酶體：Ne

15、utral Red (中性紅)、AO (吖啶橙)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：DiOC6高爾基體：NBD C6-ceramide、Bodipy FL C5-ceramide、Bodipy TR C5-ceramide檢測(cè)細(xì)胞器部分探針可直接進(jìn)入死細(xì)胞(包括固定細(xì)胞) 或活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)活體細(xì)胞或組織功能共聚焦顯微鏡可觀察特異熒光探針標(biāo)記的單個(gè)細(xì)胞不同部位或不同組織區(qū)域接受刺激后的整個(gè)變化過(guò)程，常用于對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)各種離子(Ca2+、pH等)、膜電位、活性氧的比例及動(dòng)態(tài)變化作毫秒級(jí)實(shí)時(shí)定量分析。也可通過(guò)熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間分子流動(dòng)情況。常用探針：Ca2+ ：Fluo-3、Indo-1、Fura-2pH：

16、BCECF、SNARF-1實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)活體細(xì)胞或組織功能共聚焦顯微鏡可觀察特異熒光探針染料負(fù)載方法樣品為細(xì)胞還是組織需負(fù)載的是所有細(xì)胞還是部分細(xì)胞樣品細(xì)胞的大小染料分子的大小負(fù)載對(duì)細(xì)胞活性和功能的影響染料定量及定位的精確度孵育法，損傷導(dǎo)入法，轉(zhuǎn)基因法染料負(fù)載方法樣品為細(xì)胞還是組織熒光淬滅 淬滅指熒光分子的不可逆破壞。其主要原因是：光照促使處于激發(fā)態(tài)的熒光分子與其他分子相互作用引起碰撞淬滅；熒光分子與外部分子或離子形成非熒光復(fù)合物；共振能量轉(zhuǎn)移；pH值、溫度等環(huán)境條件的影響。熒光淬滅 淬滅指熒光分子的不可逆破壞。其主要原因是：防止淬滅的方法降低激光強(qiáng)度適當(dāng)減少掃描時(shí)間適當(dāng)降低染料濃度降低氧含量使用防淬滅劑(不適用于活細(xì)胞觀察)防止淬滅的方法降低激光強(qiáng)度串色的解決方法在兩種或以上熒光探針之間，如果熒光發(fā)射峰很近，那么熒光光譜彼此會(huì)有部分重疊，檢測(cè)時(shí)可能出現(xiàn)一種熒光探針的信號(hào)擴(kuò)散到另一熒光通道的情況。這種現(xiàn)象稱為串色。串色的解決方法在兩種或以上熒光探針之間，如果熒光發(fā)射峰很近，串色的解決方法光譜檢測(cè)器序列掃描專業(yè)軟件Dye Finder串色的解決方法光譜檢測(cè)