耐藥結(jié)核病診斷新技術(shù)-課件

1、耐藥結(jié)核病診斷新技術(shù)耐藥結(jié)核病診斷新技術(shù)全球范圍內(nèi)結(jié)核病疫情嚴(yán)重 患病率高: 新發(fā)患者1040萬(wàn)/年,其中有120萬(wàn)(11%)HIV患者; 死亡率高:每年死亡人數(shù)達(dá)140萬(wàn)(13、46%),HIV/TB:死亡人數(shù)40萬(wàn)(33、33%); 耐藥率高: 48萬(wàn)新發(fā)的MDR-TB病例和10萬(wàn)耐利福平結(jié)核病(RR-TB)病例; 接受MDR檢測(cè)、報(bào)告和治療的MDR-TB不足1/3,接受治療的MDR-TB治愈成功率只有50% 全球結(jié)核病報(bào)告全球范圍內(nèi)結(jié)核病疫情嚴(yán)重全球結(jié)核病報(bào)告耐藥結(jié)核病診斷新技術(shù)-課件2015年全球估計(jì)MDR-TB患者數(shù)2015年全球估計(jì)MDR-TB患者數(shù)結(jié)核病快速及時(shí)診斷是結(jié)核病防控重

2、要因素結(jié)核病快速及時(shí)診斷是結(jié)核病防控重要因素靈敏準(zhǔn)確操作簡(jiǎn)便檢測(cè)時(shí)間短閉管檢測(cè)檢測(cè)位點(diǎn)全面對(duì)新型耐藥檢測(cè)技術(shù)的要求靈敏準(zhǔn)確操作簡(jiǎn)便檢測(cè)時(shí)間短閉管檢測(cè)檢測(cè)位點(diǎn)全面對(duì)新型耐藥檢測(cè)耐藥結(jié)核病診斷新技術(shù)-課件基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)結(jié)核病耐藥與基因64-68% rps L 基因突變70% emb B基因突變70%65%耐藥基因93%95%95% rpo B基因突變利福平異煙肼50-70% kat G基因突變5-10% inh A基因突變6-13% ahp C基因啟動(dòng)子區(qū)域突變鏈霉素乙胺丁醇 多數(shù)研究報(bào)告提示:耐藥的發(fā)生與結(jié)核桿菌的基因突變有關(guān)?？傮w上是基因一個(gè)或幾個(gè)核苷酸突變(表現(xiàn)增加、缺失、替代),

3、造成核苷酸編碼錯(cuò)誤致氨基酸錯(cuò)位排列,影響藥物與靶位酶結(jié)合產(chǎn)生耐藥結(jié)核病耐藥與基因64-68% rps L 基因突變70% e基因芯片(原理)激光共焦掃描儀軟件判讀樣品制備儀雜交儀 基因芯片方法是基于結(jié)核桿菌的利福平和異煙肼耐藥性相關(guān)的rpoB/katG/inhA的基因位點(diǎn)發(fā)生突變,通過(guò)PCR擴(kuò)增、和固定于尼龍膜上的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交、掃描,檢測(cè)熒光信號(hào)的有無(wú),判斷特定位點(diǎn)的突變情況和結(jié)核菌耐藥性。 基因芯片儀和試劑獲國(guó)家SFDA和歐盟CE認(rèn)證10基因芯片(原理)激光共焦掃描儀軟件判讀樣品制備儀雜交儀 基因芯片法基因芯片法耐藥結(jié)核病診斷新技術(shù)-課件利福平的耐藥位點(diǎn)利福平的耐藥位點(diǎn)MSM恥垢分枝

4、桿菌 MTC結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群MTR次要分枝桿菌MIN胞內(nèi)分枝桿菌MAV鳥(niǎo)分枝桿菌MGA胃分枝桿菌MKA堪薩斯分枝桿菌MSC瘰癘分枝桿菌MUA母牛分枝桿菌MCH龜分枝桿菌龜亞種MAB龜分枝桿菌膿腫亞種MSZ蘇爾加分枝桿菌MMA海/潰瘍分枝桿菌MXE蟾蜍分枝桿菌MDI迪氏分枝桿菌MFO偶發(fā)/豬分枝桿菌MGI淺黃分枝桿菌MSI猿猴分枝桿菌MTE土分枝桿菌MPH草分枝桿菌CC質(zhì)控點(diǎn)MNO不產(chǎn)色分枝桿菌MGO戈登分枝桿菌同時(shí)鑒定MTC與21種NTMMSM恥垢分枝桿菌 MTC結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群MTR次要分枝桿非結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌在國(guó)內(nèi)4個(gè)省的4個(gè)地市級(jí)CDC進(jìn)行了評(píng)估。在國(guó)內(nèi)4個(gè)省的4個(gè)地市級(jí)C

5、DC進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)核病和非結(jié)核的診斷結(jié)核病和非結(jié)核的診斷特 點(diǎn)標(biāo)本:菌株、涂陽(yáng)痰標(biāo)本 時(shí)間:約8小時(shí)優(yōu)點(diǎn):高通量靈敏度、特異度高特 點(diǎn)標(biāo)本:菌株、涂陽(yáng)痰標(biāo)本 國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議基因芯片能夠用于: 可疑耐藥結(jié)核病患者篩查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)推薦理由:在我國(guó)獲得注冊(cè)證書(shū);國(guó)內(nèi)研究顯示其敏感性和特異性較好;民族品牌數(shù)據(jù)顯示在我國(guó)具有可行性,符合成本效果;估計(jì)使用層級(jí): 地市和省級(jí)(醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu))國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議基因芯片能夠用于: 推薦理由:估探針熔解曲線技術(shù)探針熔解曲線技術(shù)工作原理 在一定環(huán)境下,DNA雙鏈在其長(zhǎng)度和序列一定時(shí),Tm值也一定,當(dāng)發(fā)生

6、錯(cuò)配時(shí),Tm值下降,下降的幅度與發(fā)生錯(cuò)配的堿基數(shù)目、類(lèi)型和位置有關(guān)。Tm工作原理 在一定環(huán)境下,DNA雙鏈在其長(zhǎng)度和序列一定時(shí),T96%利福平耐藥突變發(fā)生在rpoB507-533共81bp區(qū)域內(nèi)利福平耐藥突變檢測(cè)體系示意圖依照靶序列熔點(diǎn)的變化,檢測(cè)rpoB基因 是否含有突變,獲得利福平耐藥信息96%利福平耐藥突變發(fā)生在rpoB507-533共81bp區(qū)依照不同的Tm值能夠判斷出ropB估計(jì)不同的堿基發(fā)生突變依照不同的Tm值能夠判斷出ropB估計(jì)不同的堿基發(fā)生突變耐藥結(jié)核病診斷新技術(shù)-課件依照不同的Tm值能夠判斷出ropB估計(jì)不同的堿基發(fā)生突變依照不同的Tm值能夠判斷出ropB估計(jì)不同的堿基發(fā)生

7、突變異煙肼耐藥突變檢測(cè)體系示意圖通過(guò)檢測(cè) katG315、inhA 啟動(dòng)子和、ahpC 啟動(dòng)子區(qū)、inhA94 、密碼子的突變與否確定樣品對(duì)異煙肼的耐藥性。異煙肼耐藥突變檢測(cè)體系示意圖通過(guò)檢測(cè) katG315、inh依照不同的Tm值能夠判斷出異煙肼不同的堿基序列發(fā)生突變依照不同的Tm值能夠判斷出異煙肼不同的堿基序列發(fā)生突變依照不同的Tm值能夠判斷出異煙肼不同的堿基序列發(fā)生突變依照不同的Tm值能夠判斷出異煙肼不同的堿基序列發(fā)生突變乙胺丁醇鏈霉素氟喹諾酮每個(gè)突變都表現(xiàn)出特有的譜線 對(duì)應(yīng)獨(dú)特的熔點(diǎn), 軟件能夠自動(dòng)地給出突變類(lèi)型,即使發(fā)生不均一突變的情況,也能夠分辨出來(lái)、乙胺丁醇鏈霉素氟喹諾酮每個(gè)突變

8、都表現(xiàn)出特有的譜線 對(duì)應(yīng)獨(dú)特的步驟二加入1-96個(gè)提取樣本到檢測(cè)管中步驟三集成多重PCR和結(jié)果自動(dòng)報(bào)告步驟一自動(dòng)提取1-24份樣本操作流程總耗時(shí)約3小時(shí),手工操作時(shí)間約15分鐘步驟二步驟三步驟一操作流程總耗時(shí)約3小時(shí),手工操作時(shí)間約15(一)DNA提取40 min高質(zhì)量的樣本DNA 樣本類(lèi)型:痰液、灌洗液、培養(yǎng)菌株快速高效,1小時(shí)內(nèi)完成24份樣本提取;靈活可控,單次運(yùn)行可處理124 份樣本;高度均一,整個(gè)提取過(guò)程均由儀器自動(dòng)完成,保證了提取樣本的均一性。(一)DNA提取40 min高質(zhì)量的樣本DNA (二)加入PCR反應(yīng)管(二)加入PCR反應(yīng)管(三)PCR過(guò)程和自動(dòng)判讀菌種Tm / FAMHE

9、XROXCy5恥垢分枝桿菌83、0/73、0,80、0/牛分枝桿菌62、5,75、5/73、0,80、0/瘰疬分枝桿菌69、5/73、0,80、0/結(jié)核分枝桿菌62、5/73、0,80、0/龜分枝桿菌55、5/73、0,80、0/猿猴分枝桿菌/81、073、0,80、0/嗜血分枝桿菌/76、073、0,80、0/戈登分枝桿菌/71、073、0,80、0/堪薩斯分枝桿菌/66、573、0,80、0/膿腫分枝桿菌/58、073、0,80、0/偶然分枝桿菌/65、5,73、0,80、0/海/潰瘍分枝桿菌/59、5,73、0,80、0/土地分枝桿菌/55、5,73、0,80、0/不產(chǎn)色分枝桿菌/50、5,73、0,80、0/蘇加分枝桿菌/73、0,80、082、