免疫共沉淀原理及注意事項課件

1、一 實驗原理 以（抗體和抗原）之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究（蛋白質(zhì)相互作用）的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整（細(xì)胞內(nèi)生理性）相互作用的有效方法。 如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。 問題：細(xì)胞怎樣保持生理狀態(tài)-不變性？抗X一 實驗原理 以（抗體和抗原）之間的專一性作用為基應(yīng)用與區(qū)別測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔 與只取決于檢測焦點是初級靶分子（抗原）還是次級靶分子（相互作用蛋白）應(yīng)用與區(qū)別實驗基本原理1.提取蛋白2.在細(xì)胞裂解液中加入抗X的抗體3.孵育后再加入 A或G(于 上) 若細(xì)胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，

2、就可以形成復(fù)合物：“YX抗X抗體 A或G3.經(jīng)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物又被分開。（抗原、x抗體）有一個很重要的特性就是能與抗體的段結(jié)合 瓊脂糖珠實驗基本原理1.提取蛋白有一個很重要的特性就是能與抗體的段結(jié)原理圖解原理圖解瓊脂糖珠復(fù)合物 A是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，能特異性地與人和哺乳動物抗體（主要是）的區(qū)結(jié)合。目前多用 預(yù)先結(jié)合在 上。瓊脂糖珠復(fù)合物 A是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，能特異性的作用及具體原理“捕獲”抗體，形成復(fù)合物， 抗體-目的蛋白 非共價健結(jié)合 共價結(jié)合加樣緩沖液-煮沸變性-離心 管（抗體-目的蛋白-少量非特異性吸附蛋白）。的作用及具體原理“捕獲”抗體，形

3、成復(fù)合物，二 特征優(yōu)點（1 相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)（2 蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響（3 可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物二 特征優(yōu)點二 特征局限性（1 可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用（2 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，有第三者在中間起橋梁作用；（3 必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果。二 特征局限性 三 實驗流程 提取細(xì)胞總蛋白 離心，上清電泳(抗原抗體) 準(zhǔn)備珠子，洗3遍 珠子加入蛋白裂解液（去除非特異性蛋白背景) 離心去珠子，取上清 測蛋白濃度 (法) 加一

4、抗反應(yīng)(4過夜) 加珠子捕捉復(fù)合物 (室溫1h或4過夜) 離心，收集沉淀，預(yù)冷 洗3遍 上樣緩沖液懸浮沉淀，加熱游離抗原、抗體、珠子 三 實驗流程 四 實驗結(jié)果分析 分析質(zhì)譜分析檢測目的蛋白四 實驗結(jié)果分析結(jié)果分析 標(biāo)難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性。 以每個蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對數(shù)對它的相對遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量。 結(jié)果分析 標(biāo)難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分一抗一抗一抗(兔抗) 曝光后的蛋白條帶二抗 (辣根酶標(biāo)記的羊抗兔)X光片曝光顯影 試劑含有轉(zhuǎn)印蛋白的膜 +轉(zhuǎn)印膜上蛋白檢測示意圖 結(jié)果分析一抗一抗一抗(兔抗) 曝光后的蛋白條帶二抗 (

5、辣根酶標(biāo)記的羊與質(zhì)譜分析流程與質(zhì)譜分析流程三 實驗的關(guān)鍵1. 實驗最需要注意點就是抗體的性質(zhì)。特別是多抗的特異性是問題。2. 為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行實驗。3. 考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。4. 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。？三 實驗的關(guān)鍵注意的問題：1.裂解液 細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（40或 100)。每種細(xì)胞的裂

6、解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定。 不能用高濃度的變性劑（0.2)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的。注意的問題：1.裂解液 細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破裂解液普利萊基因技術(shù)有限公司100 ： 50 ( 7.4), 150 , 1% 40, 0.1% .（100元）說明：1. 裂解液臨用前可新鮮加入最終濃度為1的或其它蛋白酶抑制劑。2. 裂解液中蛋白樣品含有較高濃度的去垢劑，不能用法但可用法或改良法測定蛋白濃度裂解液普利萊基因技術(shù)有限公司100 ：裂解液成分 國內(nèi)博士： 細(xì)胞裂解液： 50 （7.5）， 150 , 0.540, 1 使用前加入至終濃度1、 （混合物）。 劉巖 30

7、0 20 , 8.0, 300 , 0.2 , 10% （甘油）, 0.2 , 0.2 20裂解液成分 國內(nèi)博士：2.1免疫沉淀中抗體的選擇2.1免疫沉淀中抗體的選擇注意的問題：2.2抗體使用對照抗體：（陰性和陽性） 陰性：單克隆抗體：同一種屬的 兔多克隆抗體：正常兔 陽性：細(xì)胞內(nèi)某種蛋白的抗體（做膜蛋白A，用膜蛋白B）注意的問題：2.2抗體使用對照抗體：（陰性和陽性）未檢測到目得蛋白或蛋白很少 可能原因 處理方法1.樣品被蛋白酶降解： 添加蛋白酶抑制劑；所有操作保持4以下冰上操作并防止凍融2.抗體濃度太低：調(diào)整抗體濃度，必要時設(shè)立濃度梯度，摸索最佳濃度3.抗抗體親合力太低： 選用適合于和/或的相應(yīng)抗體4抗體未與珠子結(jié)合： 選用適合于的相應(yīng)珠子，正確保存防止變質(zhì)或干燥5未暴露在融合蛋白構(gòu)象的表面：改變?nèi)诤媳磉_(dá)部位6.裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太高： 改用低嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液未檢測到目得蛋白或蛋白很少 可能原因 目得蛋白高背景：可能原因 處理方法非特異蛋白結(jié)合 在無血清培養(yǎng)液中裂解細(xì)胞； 在免疫沉淀前用 ()珠子預(yù)洗， 免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和嚴(yán)謹(jǐn)度（高鹽或去垢劑）裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太低 改用高嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液實驗儀器或液體被污染 使用潔凈的儀器或液體轉(zhuǎn)移膜上的非特異吸附 戴手套， 用鑷子夾取， 不要接觸膜轉(zhuǎn)移面目得蛋白高背