乙肝病毒DNA的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)課件

1、乙肝病毒DNA的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)乙肝病毒DNA的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)熒光定量PCR技術(shù)熒光定量PCR技術(shù)熒光定量PCR技術(shù)Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)通過(guò)兩個(gè)短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶（TaqDNA聚合酶）的作用，經(jīng)過(guò)高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個(gè)步驟在3個(gè)小時(shí)內(nèi)反復(fù)循環(huán)25-30次，把特定的DNA片段擴(kuò)增1000萬(wàn)倍。 每個(gè)PCR體系含4種主要成分：含有待擴(kuò)增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）熒光定量PCR技術(shù)Polymerase chain reac 實(shí)時(shí)熒光定量P

2、CR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)未知的起始模版進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對(duì)已知基因序列的核酸測(cè)定中最靈敏的方法。熒光定量PCR技術(shù) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)PCR 反應(yīng)過(guò)程5533d.NTPsTaq 酶Primers5353535353535353反應(yīng)組分變 性535353535353PCR 反應(yīng)過(guò)程5533d.NTPsTaq 酶Pri延 伸53535353353TaqTaq55重 復(fù)退 火延 伸535353533535353535355335353循環(huán)24個(gè)拷貝循環(huán)38個(gè)

3、拷貝53535353535353535353533553535353535353535533535熒光定量PCR原理插入染料法 SYBR Green I雜交探針?lè)?最常用) TaqMan熒光定量PCR原理插入染料法TaqMan探針5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反應(yīng)體系變 性535353535353Taql53RQProbe53RQTaqMan探針5533d.NTPsTaq酶Prim535353RQ退 火531. 鏈取代Taq3QR5533QTaqR52. 水 解3. 聚 合53QTaqR354. 檢測(cè)熒光533QTaqR5l535353RQ退 火53

4、1. 鏈取代T乙肝病毒的感染乙肝病毒的感染乙肝病毒的感染 （一） 乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)HBsAg：是HBV感染的主要標(biāo)志HBsAb：保護(hù)性抗體HBcAg：僅存于感染的肝細(xì)胞核內(nèi)，一般不存在于血循環(huán)中HBcAb: 非保護(hù)性抗體，HBcAb-IgM提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)HBeAg：HBV復(fù)制及強(qiáng)感染性的指標(biāo)HBeAb：有一定的保護(hù)作用，預(yù)后良好乙肝病毒的感染 （一） 乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)及乙肝病毒的感染（二） HBV-DNA與“兩對(duì)半”1. “兩對(duì)半” ：機(jī)體的免疫反應(yīng)狀態(tài)；2. “攜帶者”、“大三陽(yáng)”、“小三陽(yáng)”等免疫學(xué)指標(biāo)不能 反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。FQ-PCR：檢測(cè)的是HBV本身的遺

5、傳物質(zhì)DNA，是 病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)。HBsAg()HBV-DNA() HBeAg ()HBV-DNA()3. 血清學(xué)指標(biāo)()不能排除HBV感染。乙肝病毒的感染（二） HBV-DNA與“兩對(duì)半”1. “乙肝病毒的感染陽(yáng)性標(biāo)本HBV DNA檢出率90左右 HBeAg與HBV DNA有著良好的相關(guān)性4. 也可能出現(xiàn)HBsAg()，HBV-DNA()。乙肝病毒的感染陽(yáng)性標(biāo)本HBV DNA檢出率90左右4. 也乙肝病毒的感染HBV DNAHBV DNA貫穿感染者的終生，是評(píng)價(jià)病毒復(fù)制的金標(biāo)準(zhǔn)ALT正常增高或者波動(dòng)正常增高或者波動(dòng)免疫耐受期免疫清除期非活動(dòng)或低（非）復(fù)制期再活動(dòng)期肝組織

6、學(xué)無(wú)明顯異常, 或輕度炎癥纖維化中度或嚴(yán)重炎癥、纖維化快速進(jìn)展無(wú)炎癥或僅有輕度炎癥中度或嚴(yán)重炎癥、肝纖維化臨床診斷慢性HBV攜帶者HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化非活動(dòng)性HBsAg攜帶者HBeAg陰性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化乙肝病毒的感染HBV DNAALT正常增高或者波動(dòng)正常增高或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)未知的起始模版進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對(duì)已知基因序列的核酸測(cè)定中最靈敏的方法。血清學(xué)指標(biāo)()不能排除HBV感染。HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的

7、指標(biāo)中度或嚴(yán)重炎癥、肝纖維化非活動(dòng)性HBsAg攜帶者每個(gè)PCR體系含4種主要成分：含有待擴(kuò)增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）也不是所有“小三陽(yáng)”的病人HBV都無(wú)復(fù)制?！皟蓪?duì)半” ：機(jī)體的免疫反應(yīng)狀態(tài)；HBV DNA檢測(cè)的臨床意義一般不存在于血循環(huán)中HBV DNA是患者具有傳染性的標(biāo)志血清學(xué)指標(biāo)()不能排除HBV感染。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)未知的起始模版進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對(duì)已知基因序列的核酸測(cè)定中最靈敏的方法。每個(gè)PCR體系含4

8、種主要成分：含有待擴(kuò)增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）每個(gè)PCR體系含4種主要成分：含有待擴(kuò)增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）乙肝病毒的感染慢性HBV感染分期及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo) 魯鳳民，莊輝，乙型肝炎實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒HBV-DNA與臨床HBV-DNA與臨床HBV DNA檢測(cè)的臨床意義HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù)HBV DNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志HBV DNA是患者具有傳染性的標(biāo)志HBV DNA對(duì)乙肝兩對(duì)半起補(bǔ)充作用HBV DNA是目前判斷

9、乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)HBV DNA可檢測(cè)出隱匿性慢性乙型肝炎HBV DNA檢測(cè)的臨床意義HBV DNA是HBV存在最直接（二） HBV-DNA與“兩對(duì)半”P(pán)olymerase chain reaction(PCR)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù)?！皵y帶者”、“大三陽(yáng)”、“小三陽(yáng)”等免疫學(xué)指標(biāo)不能 反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。（二） HBV-DNA與“兩對(duì)半”HBcAb: 非保護(hù)性抗體，HBcAb-IgM血清學(xué)指標(biāo)()不能排除HBV感染。每個(gè)PCR體系含4種主要成分：含有待擴(kuò)增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）也不是所有“小三陽(yáng)

10、”的病人HBV都無(wú)復(fù)制。每個(gè)PCR體系含4種主要成分：含有待擴(kuò)增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）HBV DNA是患者具有傳染性的標(biāo)志HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)非活動(dòng)性HBsAg攜帶者中度或嚴(yán)重炎癥、肝纖維化實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)未知的起始模版進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對(duì)已知基因序列的核酸測(cè)定中最靈敏的方法。提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù)HBV DNA檢測(cè)的臨床意義PCR所用引物

11、相應(yīng)的DNA序列發(fā)生突變，此引物與突變DNA不能配對(duì)結(jié)合。PCR檢測(cè)“窗口期”核酸檢測(cè)縮短的“窗口期”的天數(shù)HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利于獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷提供直接證據(jù)縮短“窗口期”HBV DNA檢測(cè)的臨床意義（二） HBV-DNA與“兩對(duì)半”P(pán)CR檢測(cè)“窗口期”核 調(diào)查表明并不是所有“大三陽(yáng)”的病人都處于HBV復(fù)制期，具有傳染性；也不是所有“小三陽(yáng)”的病人HBV都無(wú)復(fù)制。因此，要準(zhǔn)確知道HBV是否處于復(fù)制狀態(tài)，最準(zhǔn)確的方法還是通過(guò)檢測(cè)HBV DNA來(lái)決定。HBV DNA檢測(cè)的臨床意義 調(diào)查表明并不是所有“大三陽(yáng)”的病人都處于HBV復(fù)制期，乙肝病毒DNA的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)課件乙肝病毒DNA的實(shí)驗(yàn)