克隆載體特征與類型

1、關(guān)于克隆載體的特征及類型第1頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四載體：攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具。能夠運(yùn)載外源DNA片段（目的基因）進(jìn)入受體細(xì)胞，具有自我復(fù)制能力，使外源DNA片段在受體細(xì)胞中得到擴(kuò)增和表達(dá)，不被受體細(xì)胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類DNA分子。第2頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四第一節(jié) 載體的功能及特征載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件第3頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四載體應(yīng)具備的條件有復(fù)制起點(diǎn)，在受體細(xì)胞中能自我復(fù)制，或整合到染色體DNA

2、上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制；具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)；具有篩選轉(zhuǎn)化子的選擇性標(biāo)記基因；分子量小，拷貝數(shù)多；具有較高的外源DNA的載裝能力；安全，不含對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，不會(huì)任意轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞以外的其它生物細(xì)胞中。第4頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四自主復(fù)制型載體和附加載體的擴(kuò)增方式 第5頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四載體的類型應(yīng)用范圍：克隆載體、表達(dá)載體。應(yīng)用對(duì)象：原核載體、真核載體（酵母、植物和動(dòng)物）、穿梭載體。構(gòu)建來(lái)源：質(zhì)粒載體、病毒或噬菌體載體、質(zhì)粒DNA與病毒或噬菌體DNA組成的載體、質(zhì)粒DNA與染色體DNA片段組成的

3、載體。第6頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四克隆載體(cloning vector) 用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增的載體。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。表達(dá)載體(expression vector) 使目的基因在宿主細(xì)胞中得以表達(dá)的載體?？蓪⒅亟M體DNA導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞，使所載的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。第7頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四穿梭載體(shuttle vector) 又稱雙功能載體，能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制的載體。同時(shí)具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)和真核生物可識(shí)別的病毒復(fù)制原點(diǎn)或酵母菌的自主復(fù)制序列(ARS)，

4、它既能在原核細(xì)胞中擴(kuò)增又能在真核細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)。主要用于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，通常是將載體和待克隆的真核生物DNA片段先在細(xì)菌中克隆，再轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞中表達(dá)，并可提高外源基因的表達(dá)效率。第8頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四第二節(jié) 質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子；絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型質(zhì)粒常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1 - 200 kb第9頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四天然DNA質(zhì)粒具有3種構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)狀(cccDNA)、開(kāi)環(huán)(ocDNA)

5、和線性(lDNA)構(gòu)型。 Plasmid chromosome 絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA第10頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征1. 質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA的復(fù)制受質(zhì)粒和宿主細(xì)胞雙重遺傳系統(tǒng)的控制根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒 1 - 5 拷貝 stringent plasmid松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒 10 - 60 拷貝 stringent plasmid第11頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45

6、分，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制 質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合oriE.coli ColE1 plasmid復(fù)制方向rop（+）RopRNA IIRNA I3553RNAII是復(fù)制的正向調(diào)節(jié)分子，RNAI是復(fù)制的負(fù)調(diào)節(jié)物 第12頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機(jī)制 質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系第13頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9

7、點(diǎn)45分，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征2. 質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容粒組成不相容性群。親緣關(guān)系密切的質(zhì)粒；野生型質(zhì)粒與其衍生的重組質(zhì)粒。第14頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)

8、制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過(guò)若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)(親和性質(zhì)粒)其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)第15頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征3. 質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等如Col、R的其它成員非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過(guò)程由 bom 和mo

9、b 基因決定第16頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四由rec基因控制，使質(zhì)粒整合到染色體基因組上。在基因工程應(yīng)用的是重組缺陷型（rec）的質(zhì)粒和菌株。質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征4. 質(zhì)粒的重組性第17頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征5. 攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成 抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義第18頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星

10、期四 利用抗性基因進(jìn)行重組子的篩選第19頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四質(zhì)?；蚓幋a的特性Fertility /F質(zhì)粒：只含有tra基因，除了促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移外沒(méi)有其他功能。Resistance / R質(zhì)粒：含有氯霉素、青霉素等抗性基因。如RP4，發(fā)現(xiàn)于假單胞桿菌。Col 質(zhì)粒：編碼大腸菌素，可以殺死其他細(xì)菌，如存在于E. coli 中的CoE1。降解質(zhì)粒（Degradative plasmids）:可以降解特殊的分子如：甲苯，水楊酸。致瘤質(zhì)粒（Virulence plasmids）：農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒。第20頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四天然存在的兩

11、種質(zhì)粒colE1宿主細(xì)菌大腸桿菌，6.5kb，松弛型復(fù)制20-30/cellpSC101宿主細(xì)菌沙門(mén)氏菌，8.8kb，嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制5/cell，標(biāo)記基因?yàn)門(mén)cr質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)建第21頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具備的條件分子量較小。 松馳型，在受體細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)。具有一個(gè)以上的選擇標(biāo)記基因，形成重組質(zhì)粒后，至少還要有一個(gè)強(qiáng)的選擇標(biāo)記。具有允許外源DNA片段克隆的位點(diǎn)，并且位于選擇標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)，插入外源片段不影響質(zhì)粒的復(fù)制功能。能夠?qū)爰闹骷?xì)胞，具備轉(zhuǎn)化的功能。操作簡(jiǎn)單方便，可根據(jù)需要加裝其它元件，構(gòu)建不同用途的質(zhì)粒載體。第22頁(yè)，共59頁(yè)，2022

12、年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建：（1）加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于用作選擇（2）增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組（3）縮短長(zhǎng)度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量（4）改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝（5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件 方法就是重組，拼拼接接，挖肉補(bǔ)瘡。質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的第23頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四質(zhì)粒質(zhì)粒的分類人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類： 高拷貝質(zhì)

13、粒 突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù)1000-3000 擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒 來(lái)自pSC101 拷貝數(shù)小于10 表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測(cè)序質(zhì)粒 含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn) 便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒 裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子 便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒 裝有報(bào)告基因 便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選第24頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制 pBR322： 氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù) 50 - 100 /

14、cell用于基因克隆 第25頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四優(yōu)點(diǎn)：分子量?。?363bp, 容易純化。含有2個(gè)抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作為選擇標(biāo)記。而且每一個(gè)標(biāo)記基因都含有單一的酶切位點(diǎn)，可以插入DNA，amp基因內(nèi)可被Pst I, Pvu I, Sac I切開(kāi)，而四環(huán)素抗性基因可被BamH I, Hind III切開(kāi)，通過(guò)插入失活篩選重組子。受體細(xì)胞內(nèi)，pBR322以多拷貝存在，一般一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可達(dá)到50-100個(gè)，而在蛋白質(zhì)合成抑制劑存在條件下，如氯霉素，可達(dá)到1000-3000拷貝。缺點(diǎn)：有被動(dòng)遷移的可能，不夠安全?？股貥?biāo)記插入失活篩選為負(fù)篩選法，比

15、較麻煩。第26頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板第27頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18 / 19： 拷貝數(shù) 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和測(cè)序 裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記 lacZ第28頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四pUC18也來(lái)自于pBR322，但只保留了復(fù)制起點(diǎn)和ampR位點(diǎn)，ampR基因的序列已改變限制性位點(diǎn)不再存在，所有的克隆位點(diǎn)集中在lacZ基因內(nèi)的一個(gè)小片段上。pUC18的優(yōu)點(diǎn)：1）突變位點(diǎn)位

16、于復(fù)制起點(diǎn)，提高了拷貝數(shù)。2) 重組子的鑒定可一步完成，固體培養(yǎng)基中添加amp和X-gal, IPTG，節(jié)約了一半的時(shí)間。3）多克隆位點(diǎn)，可以使具有不同粘端的DNA片段插入載體，而不必連接linker。4）載體中的多克隆位點(diǎn)與M13mp系列的載體是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接轉(zhuǎn)入M13mp載體，可以進(jìn)行DNA測(cè)序和體外定點(diǎn)突變。第29頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18 / 19：正選擇標(biāo)記 lacZ 的顯色原理pUC18/19PlaclacZMCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖

17、苷X-gal第30頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四第31頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGEM-3Z：多拷貝裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記 lacZ用于外源基因的高效表達(dá) 注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等第32頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四在重組的pGEM3Z載體中加入相應(yīng)的

18、RNA聚合酶，可以發(fā)生外源基因轉(zhuǎn)錄。第33頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四質(zhì)粒載體總體評(píng)價(jià)操作簡(jiǎn)便克隆容量有限（ 10kb）第34頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四第二節(jié) 噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來(lái)。高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增第35頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl 噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)l 噬菌體由外殼包裝

19、蛋白和l-DNA組成 l-DNA全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸l-DNA上至少有61個(gè)基因約有20kb的區(qū)域?yàn)闉槭删w生長(zhǎng)非必需的，可以缺失或被外源DNA片段所取代。第36頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四l 噬菌體生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l - DNA黏性末端第37頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl 噬菌體生物學(xué)特性

20、： 感染周期E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解第38頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl 噬菌體生物學(xué)特性： 感染周期體內(nèi)包裝100個(gè)左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75 - 105%即 36 - 51 kbDA第39頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl 噬菌體生物學(xué)特性： 溶原狀態(tài) l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿

21、主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于裂解狀態(tài) DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)第40頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度 野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體： 插入型載體取代型載體第41頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月2

22、0日，9點(diǎn)45分，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度 插入型載體體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長(zhǎng)度 37 kb插入片段大?。? - 14 kb（51 37）重組與否均可包裝，因而為區(qū)分重組子與非重組子必須攜帶標(biāo)記基因。第42頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度 取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長(zhǎng)度 10 kb（51 26）載體長(zhǎng)度 26 kb插入片段最大裝載長(zhǎng)度 25 kb（36 26）第43頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)4

23、5分，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1 - 2個(gè)同時(shí)，為了便于各種來(lái)源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)第44頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)

24、記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記第45頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記 imm434imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活， l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑第46頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記 lacZlacZ基因編碼b-半乳

25、糖苷酶，能催化無(wú)色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑第47頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA重組分子的體外包裝：l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋

26、白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的第48頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37培養(yǎng)1小時(shí) 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4 -12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒 密度已達(dá)1013 -1014 / L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解 超速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放l-DNA 乙醇或異丙醇沉淀l-DNA 第49頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四噬菌體或

27、病毒DNA大腸桿菌的 l 噬菌體DNAl-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 l-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量 重組l-DNA分子的篩選較為方便 重組l-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便 l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá) 外源基因第50頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四第三節(jié) 考斯質(zhì)粒 l-DNA載體裝載量為25 kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。 在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長(zhǎng)度，就能同步

28、增加載體的裝載能力。第51頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長(zhǎng)度，同時(shí)又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。第52頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建pHC796400 bpTcrl fragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNA cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體cos site - carrying plasmid1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段裝載范圍為31 - 45 kb第53頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)45分，星期四考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范