生理學(xué)實(shí)驗(yàn)報告-蛙類離體心臟灌流

1、蛙類離體心臟灌流一、【目的要求】1、學(xué)習(xí)斯氏離體蛙心灌流法。2、了解心肌的生理特性。3、觀察Na+,K+,Ca2+及腎上腺素（Adr）,乙酰膽堿（ACh）等對離體心臟活動的影 響。二、【原理】將離體蛙心（失去神經(jīng)支配的蛙心）保持在適宜的環(huán)境中，在一定的時間內(nèi) 仍然能夠保持節(jié)律性收縮，心臟正常的節(jié)律性活動需要一個適宜的理化環(huán)境，離 體心臟也是如此，離體心臟脫離了機(jī)體的神經(jīng)支配和全身體液因素的直接影響, 可以通過改變灌流液的某些成分，觀察其對心臟活動的作用。心肌細(xì)胞的自律性、 興奮性、傳導(dǎo)性及收縮性，都與鈉、鉀及鈣等離子有關(guān)。血鉀濃度過高時（高于7.9mmol/L）,心臟興奮性、自律性、傳導(dǎo)性及收

2、縮 性都下降，表現(xiàn)為收縮力減弱、心動過緩和傳導(dǎo)阻滯，嚴(yán)重時心臟可停搏于舒張 期。血鈣濃度升高時，心臟收縮力增強(qiáng)，過高可使心室停搏于收縮期。血鈣濃度 降低，心肌收縮力減弱。血中鈉離子濃度的輕微變化，對心肌影響不明顯，只有 發(fā)生明顯變化時，才會影響心肌的生理特性。腎上腺素可使心率加快、傳導(dǎo)加快 及心肌收縮力增強(qiáng)，乙酰膽堿那么與腎上腺素的作用相反。三、【實(shí)驗(yàn)儀器】青蛙、常用手術(shù)器械、蛙板（或蠟盤）、蛙心夾、計算機(jī)采集系統(tǒng)、張力傳感 器、支架、雙凹夾、雙針形露絲刺激電極、滴管、培養(yǎng)皿（或小燒杯）、紗布、棉 線、橡皮泥、任氏液。蛙心套管（斯氏套管或八木氏套管）、套管夾、0. 65%NaCI、 5%NaC

3、I、2%CaCI2、1%KCI、1： 5000 腎上腺素、1： 10000 乙酰肌堿、300U / mL肝素。四、【方法與步驟】1、斯氏蛙心插管法（1）一只青蛙，雙毀髓后背位置于蠟盤中，按前面的方法暴露心臟。仔細(xì) 識別心臟周圍的大血管。在左主動脈下方穿一線，于動脈圓錐處結(jié)扎（動物個體 小時一，結(jié)扎位置可靠上些）。再從左右兩主動脈下方穿一線，并打一活結(jié)備用。左手提起主動脈上的結(jié)扎線，右手用眼科剪在結(jié)扎線下方、沿向心方向?qū)用}上 壁剪一斜口。選擇大小適宜的蛙心套管，然后將盛有少量（套管內(nèi)23cm高度） 任氏液（內(nèi)加入一滴肝素溶液）的斯氏蛙心套管，山開口處插入動脈圓錐。當(dāng)套管 尖端到達(dá)動脈圓錐基部時

4、，應(yīng)將套管稍稍后退，使尖端向動脈圓錐的背部后下方 及心尖方向推進(jìn)，經(jīng)主動脈瓣插入心室腔內(nèi)（于心室收縮時插入，但不可插得過 深，以免心室壁堵住套管下口）。此時可見套管中血液沖人套管，并使液面隨心臟搏動而亡下移動，說明操作 成功（否那么需退回并重新插入）。用滴管吸去套管中的血液，更換新鮮任氏液。穩(wěn) 定住套管后，輕輕提起備用線，將左、右主動脈連同插入的套管用雙結(jié)扎緊（不得漏液），再將結(jié)線固定在套管的小玻璃鉤上，然 后剪斷結(jié)扎線上方的血管。輕輕提起套管和心臟，看清靜脈竇的位置，于靜脈竇 下方剪斷有牽連的組織，僅保存靜脈竇與心臟的聯(lián)系，使心臟離體（切勿損傷靜 脈竇）。用任氏液反復(fù)沖洗心室內(nèi)余血，使套管內(nèi)

5、灌流液不再有殘留血液。保持 套管內(nèi)液面高度一致（1.52cm）,即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（2）將插好離體心臟的套管固定在支架上，用蛙心夾夾住少許心尖部肌肉（不可夾得過多，以免因夾破心室而漏液）。 再將蛙心夾上的系線繞過一個滑輪與張力傳感器相連（如右圖）。注意：勿使灌 流液滴到傳感器上。調(diào)節(jié)顯示器上心臟收縮曲線的幅度適中。2、實(shí)驗(yàn)觀察（1）記錄正常心搏曲線（2）改用0. 65%NaQ溶液灌流，并作好加藥標(biāo)記，觀察心搏變化。待曲線氏 插管裝置出現(xiàn)明顯變化時，立即吸去套管中的灌流液，同時做好沖洗標(biāo)記，并用 新鮮任氏液清洗23次，待心搏恢復(fù)正常。注意：換液時切勿碰套管，以免影 響描記曲線的基線，同時保持灌流液面

6、一致（以下同）。觀察可得，NaCI溶液會阻遏心臟搏動。（3）向套管內(nèi)加26滴5%NaCI（較細(xì)的套管需少加）溶液，作好加藥記號，觀 察心搏曲線的頻率及振幅變化。當(dāng)曲線出現(xiàn)明顯變化時，應(yīng)立即吸去套管中的灌 流液，并做好沖洗標(biāo)記，迅速用新鮮任氏液清洗23次，待心搏恢復(fù)正常。（4）同法向套管內(nèi)加入13滴2%CaCI：溶液，觀察并記錄心搏曲線的變化。當(dāng)出現(xiàn)明顯變化時，立即更換任氏液，待心搏恢復(fù)正常（如果恢復(fù)緩慢，可屢次 沖洗）。（5）向套管中加12滴1%KCI溶液，記錄心搏曲線的變化。留神搏曲線變化 時，同法更換灌流液，待心搏恢復(fù)正常。（6）同法記錄套管中加入I2滴的腎上腺素溶液（1： 10000）后

7、心搏曲線的變化。 同法記錄套管中加入1-2滴乙酰膽堿溶液（1： 10000）后心搏曲線的變化。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析將記錄到的各段心搏曲線附在實(shí)驗(yàn)報告中，計算給藥前后曲線的頻率、振幅 和基線變化。測量結(jié)果填入表中。五、【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】1、正常博擊曲線圖2、滴加0.65%NaCI溶液圖分析：滴加0.65%NaCI溶液后，心跳減弱，這是由于用0.65%NaCI溶液灌注 蛙心時，由于灌注液中缺乏Ca2+,以致心肌細(xì)胞動作電位2期內(nèi)流Ca2+減少， 細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度減少，心肌的收縮活動也隨之減弱。3、滴加5%NaCI溶液分析：由于細(xì)胞外液中鈉濃度差梯度的變化一般對心肌活動影響不明顯。因 此上圖的心率變化與圖

8、2滴加0.65%NaCI溶液里變化并不是很大，兩個不同濃度 的相同溶液作用機(jī)理是一樣的，在此一不作過多相同分析。但如果實(shí)驗(yàn)中滴加溶 液順序不一樣，假設(shè)先滴加5%NaCI.再滴加0.65%NaCI溶液，所得的心搏變化就不 如圖3那樣明顯了，收縮力僅出現(xiàn)很微弱的變化。4、滴加2%CaCI溶液分析：細(xì)胞外Ca2 +在細(xì)胞膜上對Na+內(nèi)流有競爭性抑制作用，稱為膜屏 障作用。Ca2 + +內(nèi)流受抑制，細(xì)胞0期除極速度與幅度減小，使興奮性及傳導(dǎo) 性均降低。Ca2 + 2+內(nèi)流增多，因此慢反響細(xì)胞0期去極化加快加強(qiáng)，傳導(dǎo)性 增高，而快反響細(xì)胞平臺期縮短，有效不應(yīng)期縮短，復(fù)極加速。Ca2+內(nèi)流增多， 使心肌收

9、縮能力增強(qiáng)。Ca2 + 0降低時，所引起的變化與高鈣時相反。因此加入CaCI2后，心率減少、振幅減少，基線上移。5、滴加1%KCI溶液分析：滴加1%KCI后的心搏曲線發(fā)現(xiàn)，曲線的頻率逐漸減小，愈來愈疏， 幅度逐漸下降，最后停止在基線處，即心臟停博于舒張狀態(tài)。因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞K+濃 度增高時，K+與Ca2+有競爭性拮抗作用，K+抑制細(xì)胞膜對Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，使進(jìn)入 細(xì)胞內(nèi)Ca2+減少，心肌的興奮一收縮偶聯(lián)過程減弱，心肌收縮力降低。所以心 搏曲線振幅減小。6、滴加1： 10000腎上腺素溶液分析：滴加腎上腺素后，蛙心收縮增強(qiáng)，心臟舒張完全，描記的心搏曲線幅 度明顯增大。其作用機(jī)理是，腎上腺素可與心肌細(xì)胞膜

10、上的B受體結(jié)合，提高心 肌細(xì)胞和肌漿網(wǎng)膜Ca2+通透性，導(dǎo)致肌漿中Ca2+濃度增高，使心肌收縮增強(qiáng)。 另外，腎上腺素還有降低肌鈣蛋白與Ca2+親和力，促使肌鈣蛋白對Ca2+的釋放 速率增加，提高肌漿網(wǎng)膜攝取Ca2+的速度，刺激Na+與Ca2+交換，使復(fù)極期向 細(xì)胞外排出Ca2+的作用加速，這樣，將使心肌舒張速度增快，整個舒張過程明 顯增強(qiáng)。7、滴加1： 10000乙酰膽堿溶液分析：上圖可示，蛙心收縮減弱，心率減慢，最后出現(xiàn)蛙心停止舒張階段。 其機(jī)理為：乙酰膽堿與心肌細(xì)胞膜M受體結(jié)合，一方面提高心肌細(xì)胞膜K+通道的通透 性，促使K+外流，/min）振幅/g （上移或下移）其他對照521.47給藥

11、511.47心收縮力減弱恢復(fù)521.8對照521.8給藥512.82上移心收縮力減弱恢復(fù)622.6對照491.65收縮力沒有明顯增給藥492.16上移大，但基線上移明顯恢復(fù)501.94上移對照522.27給藥591.91稍上移心收縮力減弱恢復(fù)582.05對照511.83給藥512.64心收縮力增強(qiáng)恢復(fù)552.67對照461.06給藥01.06心收縮力減弱恢復(fù)520.77上移六、【考前須知】.制備蛙心標(biāo)本時，勿傷及靜脈竇。.上述各實(shí)驗(yàn)工程，一旦出現(xiàn)作用應(yīng)立即用正常任氏液換洗，以免心肌受損， 而且必須待心搏恢復(fù)正常后方能進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。.復(fù)習(xí)心肌生物電的產(chǎn)生機(jī)制及各種離子對心臟活動的影響。.盡量選

12、用健壯、體大的雄性蟾蛛，手術(shù)過程中注意保護(hù)心臟，防止損傷。.實(shí)驗(yàn)中及時用任氏液沖洗心臟，待曲線恢復(fù)平穩(wěn)后再進(jìn)行下一步操作。.每次更換任氏液都必須保持灌流液液面高度恒定，以免因灌流量變化而影 響結(jié)果。.嚴(yán)格控制每次藥品加入量，先加一滴，效果不明顯再加一滴。.滴加藥品和換取正常任氏液，須及時標(biāo)記，以便觀察分析。.吸滴瓶中的任氏液和吸蛙心套管內(nèi)溶液的吸管應(yīng)區(qū)分專用，不可混淆使用, 以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果?！舅伎碱}】.離體蛙心制備好后，有時候館內(nèi)的液面上下移動很不明顯，是何原因？如 何處理？答：離體蛙心制備好后，蛙心插管內(nèi)的液體應(yīng)隨蛙心室的收縮和舒張活 動而上下移動。其實(shí)質(zhì)是：在心室收縮時，心室容積減少，室

13、內(nèi)壓升高，將心室內(nèi)的液體壓 入插管內(nèi)，管內(nèi)液面上升；在心室舒張的時候，心室容積增大，心室內(nèi)壓減少，將插管內(nèi)液體吸入心室，管內(nèi)液面下降。但是有時候蛙心插管內(nèi)液面波動不明顯，其主要原因是：插管內(nèi)尖端出現(xiàn)血凝塊。插管內(nèi)液體不能順暢的進(jìn)出心室腔內(nèi)。解決方法 為用長吸管將血凝塊吸出，在吸出血凝塊后，應(yīng)立即用新鮮任氏液換洗插管內(nèi)液體幾 次，直至蛙心顏色變淡，插管內(nèi)無血液和小血塊為止。插管尖端不在心室腔內(nèi)，而是在心房或者脈間結(jié)締組織等地方。解決方法 為將插管重新插入心室，確定無誤后，再結(jié)扎固定。插管進(jìn)入心室腔內(nèi)過深，以致尖端抵住了心室壁。解決方法為將插管稍稍 外提，使插管口正好處于心室腔內(nèi)，且開口正對著液體

14、噴射的軸流方向。蛙心由于長期心肌失血，導(dǎo)致活力下降。解決方法為向插管內(nèi)滴加少許腎 上腺素或者對其進(jìn)行外加力使其起搏，使其活動增強(qiáng)。房室傳導(dǎo)阻滯。在插管的操作中，由于操作失誤，對心臟造成的損害過大， 最后導(dǎo)致房室傳導(dǎo)阻滯。由于這種傷害是不可逆轉(zhuǎn)的，所以必須改換蛙心重做實(shí) 驗(yàn)。.實(shí)驗(yàn)過程中，為什么必須保持蛙心插管內(nèi)液面高度的恒定？液面過高或過 低會產(chǎn)生怎樣的影響？答：在實(shí)驗(yàn)過程中，蛙心插管內(nèi)液面高度發(fā)生變化，心臟收縮曲線會相應(yīng)發(fā) 生變化。心肌縮短幅度和速度受到前負(fù)荷和后負(fù)荷的影響。插管液面高度所產(chǎn)生 的壓力，在心室舒張期末期相當(dāng)于心肌的前負(fù)荷，心室開始收縮的時候，此液體 所產(chǎn)生的壓力又成為心肌收縮

15、時的后負(fù)荷。故高度的改變，進(jìn)而引起的前后負(fù)荷 的改變將改變心肌收縮的幅度和頻率。當(dāng)液面過高時。心縮曲線幅度將降低。因?yàn)檫^高的液面，將使心室前負(fù)荷超 過了最適前負(fù)荷，將導(dǎo)致粗細(xì)肌絲過于疏遠(yuǎn)，而導(dǎo)致收縮的潛力減少，心肌收縮 不再增加或下降。而類似的，過高的后負(fù)荷，也使心肌收縮的幅度和速度大大下 降。而當(dāng)液面過低時，心室收縮的幅度也會減少。因?yàn)榍柏?fù)荷過小，將導(dǎo)致粗細(xì) 肌絲過于接近，而導(dǎo)致收縮的潛力減少，實(shí)際上，此時由于前負(fù)荷的減少導(dǎo)致心 室收縮的效力的減少比前負(fù)荷增加而導(dǎo)致的還有明顯。類似的，后負(fù)荷相應(yīng)的減 少也會導(dǎo)致心室收縮的減弱。所以，在實(shí)驗(yàn)中保持最適的液面高度。是取得較好實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提。.各種

16、離子成分改變蛙心收縮的原理是什么？答：由于心肌細(xì)胞生物電活動和收縮過程與離子密切相關(guān)，因此，細(xì)胞外液 中離子濃度升高或降低均會影響到心肌的電生理特性和收縮性。（1）鉀離子的影響K +與靜息電位的形成有關(guān)。細(xì)胞外液K+濃度K + 0變 化對心肌生理特性的影響較為復(fù)雜。高鉀：K + 0輕度或中度增高時，膜內(nèi)、外 K+濃度差減小，靜息電位絕對值減小，與閾電位差距縮短，因此，興奮性增高。 K+0顯著升高時，由于靜息電位絕對值減小過多（膜內(nèi)達(dá)-55mV左右），Na + 通道失活，因而興奮性降低甚至消失。另外，還使0期去極化速度和幅度減小, 傳導(dǎo)性降低，導(dǎo)致興奮傳導(dǎo)減慢，甚至傳導(dǎo)阻滯。此外，K + 0增高還可提高膜對K+的通透性，加速K+外流，動作電位平臺期縮短，因 此，不應(yīng)期縮短。此外由于平臺期縮短，減少了 Ca2+的內(nèi)流，加上細(xì)胞外K+與Ca2+在膜 上有競爭性抑制作用，導(dǎo)致心肌收縮功能減弱；（2）鈣離子的影響細(xì)胞外Ca2 +在細(xì)胞膜上對Na+內(nèi)流有競爭性抑制作用, 稱為膜屏障作用。Ca2 + +內(nèi)流受抑制，細(xì)胞0期除極速度與幅度減小，使興 奮性及傳導(dǎo)性均降低。Ca2 + 0增高使Ca2+內(nèi)流增多，因此慢反響細(xì)胞。期去 極化加快加強(qiáng)，傳導(dǎo)