哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求

1、哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求（一）營養(yǎng)成分細(xì)胞生長繁殖所需要的營養(yǎng)成分包括氨基酸、單糖、維生素、無機(jī)離子和 H O 。2氨基酸和維生素的添加量是有限的，某些氨基酸和維生素的添加量往往是憑 經(jīng)驗的，通常與某個細(xì)胞系的建立過程有密切關(guān)系。例如，F(xiàn)ishers培養(yǎng)基含 有高濃度的葉酸，這是因為L5178Y對葉酸的依賴性，在這種培養(yǎng)基的發(fā)展過程 中，葉酸就被沿用下來了。大多數(shù)細(xì)胞的培養(yǎng)基都含有葡萄糖作為能量來源，葡萄糖的主要代謝途徑是 通過無氧酵解產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可轉(zhuǎn)化為乳酸鹽或乙酰乙酸鹽，然后進(jìn)入檸檬 酸循環(huán)被氧化成CO和H 0。培養(yǎng)基中乳酸的累積在培養(yǎng)胚胎及轉(zhuǎn)化細(xì)胞時尤為 22 明顯，提示體外培

2、養(yǎng)時檸檬酸循環(huán)不能像多細(xì)胞機(jī)體內(nèi)那樣完全進(jìn)行。有證據(jù)表 明，碳源的大部分來自谷氨酰胺而非葡萄糖。這也解釋了為何某些培養(yǎng)的細(xì)胞對 谷氨酰胺和谷氨酸鹽的需求異常高。（二）促生長因子及激素促生長因子及激素在商品干粉培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中一般都不添加，含血清 培養(yǎng)液的來源正是血清本身。在無血清培養(yǎng)基中+經(jīng)常需要添加這些組分。自然凝集的血清，與利用物理方法如離心法去除細(xì)胞得到的血漿相比，對于 刺激細(xì)胞的增殖，效果更好。原因是，自然凝集的血清保留了更多的生長因子， 如血小板生長因子。（三）滲透壓和 pH培養(yǎng)基中基礎(chǔ)平衡鹽溶液組成的鹽類是維持滲透壓平衡的主要化合物，這些 鹽類主要包括 Na-、K+、Mg2+、

3、Cl-、SO2-、Ca2+、POi 和 HCO -等。43大部分培養(yǎng)基的鹽濃度是依據(jù) Eargles 和 Hanks 平衡鹽溶液而來， Eargles平衡鹽溶液的Hank，s濃度高，適合5 % CO的氣體環(huán)境Hanks平2衡鹽溶液的 HCO -濃度低，適3用于空氣環(huán)境。5%CO的氣體環(huán)境中，培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定及調(diào)節(jié)依賴于溶解在培2養(yǎng)液的 CO 氣體和組成培養(yǎng)基基礎(chǔ)平衡鹽溶液的緩沖作用。2酚紅是常用的pH指示劑，一般培養(yǎng)液中都有添加，pH7. 4呈紅色，pH7. O 變橙色，pH6. 5變黃色，而pH7. 6呈紅色中略帶藍(lán)色.pH7. 8呈紫色。由于對 顏色的觀察有很大的主觀性，因而建議操作者用無

4、菌平衡鹽溶液和同樣濃度的酚 紅配一套標(biāo)準(zhǔn)色標(biāo)，密封放在與存放培養(yǎng)液相同材質(zhì)的瓶子中。NaHCOs的濃度取決于氣相中的CO2濃度，NaH除了具有pH緩沖能力以外， 還有顯著的營養(yǎng)作用。Ca2+是某些細(xì)胞黏著能力所必需。如在懸浮培養(yǎng)時，減少 Ca2+可以減少細(xì)胞的聚集和附著。（四）無毒、無污染殘留培養(yǎng)液可以直接購買商品培養(yǎng)液，也可在購買商品干粉培養(yǎng)基后自行配制。謹(jǐn)慎使用配制用水是避免細(xì)胞毒性二價離子、有毒有機(jī)物和微生物污染的關(guān) 鍵措施。細(xì)胞毒性二價離子一般指ca”、Mg以外的二價金屬離子，它們往往 屬于微量元素，過量了容易導(dǎo)致細(xì)胞中毒，細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)諸如細(xì)胞生長分裂受 阻、細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象

5、。保存這些培養(yǎng)液的試劑瓶是否干凈無菌也顯得非常重要，并且試劑瓶是否在 常溫下會溶出細(xì)胞毒性物質(zhì)也是選擇何種試劑瓶的原則之一。一般建議使用玻璃 試劑瓶或無細(xì)胞毒性的工程塑料制造的試劑瓶。由于塑料試劑瓶反復(fù)使用時容易釋放出有害物質(zhì)，故不建議反復(fù)使用。玻璃 試劑瓶在反復(fù)使用過程中，清洗時尤其注意排除清洗劑殘留和金屬離子殘留。某 些清洗劑不宜用于玻璃試劑瓶的清洗，如洗潔精含芳香類有機(jī)物、洗衣粉含酶類 物質(zhì)，這些物質(zhì)在器皿清洗過程中，很難清除徹底，容易導(dǎo)致二次污染。一般建 議使用玻璃清洗劑、洗衣皂、去污粉等一類清潔劑。（五）抗生素常用的細(xì)胞培養(yǎng)用抗生素中，可以只使用一種，如單一使用慶大霉素或卡那 霉素都

6、比較實用便利。多數(shù)情況下，抗生素的添加都源于習(xí)慣，因此，對于受過專業(yè)、系統(tǒng)訓(xùn)練的 操作者而言，可以不需要直接添加抗生素到培養(yǎng)液中。換言之，在培養(yǎng)液購買或 利用干粉配制液體培養(yǎng)基時，添加抗生素不是必需的，主要依據(jù)操作者的熟練程 度和操作習(xí)慣決定。不建議添加的理由主要有以下幾個方面：無菌操作的客觀條件和無菌操作技術(shù)日臻成熟，在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行嚴(yán)格 的無菌操作，通常不太容易帶來微生物污染。大多數(shù)時候，某些抗生素的抗菌譜是有限的，某些環(huán)境微生物如果屬于抗 藥菌，則添加的抗生素?zé)o效。經(jīng)常使用某些抗生素，容易誘導(dǎo)產(chǎn)生培養(yǎng)環(huán)境的抗 藥菌。使用某些抗生素對培養(yǎng)細(xì)胞的生長與分裂也會產(chǎn)生一定的影響?？股卦诘蜐舛认?，其生物活性的半衰期更短，需要頻繁添加，增加操作 難度。使用抗生素可以掩蓋低程度的