微陣列-比較基因組雜交技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用

1、微陣列比力基因組雜交技能及其在腫瘤研究中的應(yīng)用【摘要】微陣列比力基因組雜交(array-GH)技能是將DNA克隆或DNAs做成微陣列，取代傳統(tǒng)GH法中中期染色體作為雜交靶，不但使區(qū)分率進(jìn)步，乃至可以確定腫瘤相干基因并提供正確的定位。全文綜述Array-GH的原理、要領(lǐng)及其在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用和意義。【關(guān)鍵詞】微陣列-比力基因組微陣列比力基因組雜交(array-parativegenihybridizatin，Array-GH)技能是將DNA克隆或DNAs做成微陣列，取代傳統(tǒng)GH檢測(cè)中將中期染色體作為雜交靶舉行檢測(cè)，不但使區(qū)分率進(jìn)步，而且還可以確定腫瘤相干基因并提供正確的定位。同時(shí)可經(jīng)盤算機(jī)軟件識(shí)別

2、每條染色體，落服了必要履歷富厚的職員識(shí)別染色體的限定，為快速全面地闡發(fā)腫瘤構(gòu)造DNA拷貝數(shù)的變革，以及染色體不不變性的檢測(cè)提供了較為抱負(fù)的要領(lǐng)。本文就該技能原理、要領(lǐng)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用作一簡(jiǎn)樸的綜述。1微陣列比力基因組雜交概述1.1Array-GH根本原理Array-GH與GH相似，但它是用DNA克隆或DNAs微陣列取代中期染色體鋪片作為雜交靶，馬上等量的差異熒光標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的待測(cè)和參照DNA經(jīng)人t-1DNA關(guān)閉非特異性重復(fù)序列后，同時(shí)雜交到由DNA克隆或DNAs構(gòu)成的微陣列上。用微陣列每個(gè)靶點(diǎn)上的兩種信號(hào)的熒光比例反響待測(cè)基因組DNA在相應(yīng)的序列或基因上的拷貝數(shù)變革15。1.2要領(lǐng)微陣列

3、可以為DNA克隆微陣列和DNAs微陣列。DNA克隆是在BA、PA或YA載體中克隆的DNA片斷。DNAs微陣列，可以從樣本中提取總RNA，再分散RNA，然后將得到的DNAs舉行PR擴(kuò)增。用專門的儀器將DNA克隆或DNAs點(diǎn)樣至覆蓋特定介質(zhì)的玻片上，根據(jù)在染色體中的漫衍，確定靶點(diǎn)的擺列挨次。為了得到正確的效果,每個(gè)靶點(diǎn)可重復(fù)點(diǎn)樣210次。點(diǎn)樣后，立即將玻片在80烘烤10in，制成微陣列玻片，存儲(chǔ)在帶有枯燥劑的盒子里，室溫保存1，2，47。待測(cè)DNA可以來(lái)自腫瘤細(xì)胞系、冷凍或白臘包埋的腫瘤構(gòu)造。應(yīng)盡大概選擇具有典范構(gòu)造學(xué)特性的腫瘤細(xì)胞，棄除壞死構(gòu)造和炎癥區(qū)及周邊正常細(xì)胞，以免滋擾。利用尺度的酚氯仿異

4、戊醇提取法分散腫瘤細(xì)胞和構(gòu)造中的DNA。對(duì)付甲醛結(jié)實(shí)、白臘包埋構(gòu)造,可以用激光捕捉顯微切割法L得到腫瘤構(gòu)造，提取DNA，再用變性引物介導(dǎo)的PRDP-PR擴(kuò)增和標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟8，參照DNA泉源于康健人血液中的白細(xì)胞或同一患者同一器官中正常構(gòu)造。對(duì)探針可以舉行直接或間接熒光標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟。標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟要擁有以下幾種：缺口平移法；隨機(jī)引物法；DP-PR法；順鉑熒光素毗連法1，9等。標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟完成后用SephadexG5旋轉(zhuǎn)柱去除未結(jié)合的核苷酸1。將差異熒光標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的待測(cè)和參照DNA各1與人t-160混淆，關(guān)閉非特異重復(fù)序列，低落本底作用。然后將待測(cè)和參照DNA80熱變性10in。37孵育12h，再

5、與已經(jīng)預(yù)熱的微陣列37雜交留宿，雜交后洗滌微陣列玻片，蓋上蓋玻片。對(duì)付DNA克隆微陣列，可以用DAPI復(fù)染，有助于定位靶克隆1，2，48。用共聚焦掃描裝置或帶有寒光源相機(jī)的光學(xué)裝備獵取圖像，并用專門的闡發(fā)軟件處置懲罰數(shù)據(jù)。必要確定實(shí)際的靶地區(qū)、靶信號(hào)強(qiáng)度和局部配景強(qiáng)度。從靶信號(hào)強(qiáng)度中扣除局部配景得到靶熒光比例。將正常標(biāo)本在微陣列全部靶點(diǎn)的均勻熒光比例調(diào)解為1，代表無(wú)DNA拷貝數(shù)變革。利用全部靶點(diǎn)的均勻熒光比例和尺度差s確定拷貝數(shù)變革的邊界。得到和缺失別離界說(shuō)為+2s和-2s，高程度擴(kuò)增界說(shuō)為2+2s7。闡發(fā)時(shí)去除在正常樣本中熒光信號(hào)不知的點(diǎn)熒光信號(hào)超過配景20和有過多熒光殘骸的點(diǎn)8。DNA拷貝

6、數(shù)圖像可以用挪動(dòng)均勻值vingaverage5個(gè)相鄰的靶表現(xiàn)。挪動(dòng)均勻值用于淘汰靶信號(hào)交織引起的偏向和低落配景8，9。1.3可行性檢測(cè)和質(zhì)量操縱Urban等10用有-glbin位點(diǎn)缺失的人用Array-GH法舉行檢考試證Array-GH檢測(cè)染色體基因組缺失或擴(kuò)增是否可靠，效果均檢測(cè)到了缺失的存在，證實(shí)該芯片體系可以正確地檢測(cè)基因或基因組的缺失。Veltan等11為用Array-GH法檢測(cè)膀胱腫瘤患者DNA拷貝數(shù)變革，為確定該技能及該芯片在檢測(cè)基因或基因組改變的可信性，先用正凡人對(duì)正凡人的構(gòu)造舉行比擬試驗(yàn)，效果沒有缺失或擴(kuò)增的信號(hào)出現(xiàn)。而在膀胱癌患者的構(gòu)造中檢測(cè)到了顯著有擴(kuò)增或缺失的信號(hào)產(chǎn)生。而

7、這些缺失或擴(kuò)增的部位，含有相應(yīng)的癌基因或抑癌基因。證實(shí)此要領(lǐng)在檢測(cè)基因擴(kuò)增或缺失中，得出的效果是可信的。1.4Array-GH的特點(diǎn)Array-GH技能具有兩方面顯著上風(fēng)：敏捷度和正確性：由于染色體DNA以高度麋集和超螺旋的情勢(shì)存在著，因此傳統(tǒng)GH只有在DNA序列缺失達(dá)10b20b細(xì)胞株或20b30b原發(fā)腫瘤以上或序列擴(kuò)增時(shí)擴(kuò)增子與擴(kuò)增拷貝數(shù)之積至少2b才被檢測(cè)出來(lái)。故傳統(tǒng)GH所提供的信息中一定包羅有為數(shù)浩繁的基因，必要作進(jìn)一步的正確定位。Array-GH避開了龐大的染色體布局，所雜交的靶序列僅為包羅了少數(shù)基因的短DNA片斷，以是能尋出傳統(tǒng)GH檢測(cè)不出的DNA序列拷貝數(shù)的差異，并同時(shí)將擴(kuò)增或缺

8、失的范疇正確地定位在某個(gè)或某幾個(gè)基因或未知基因上。主動(dòng)化、步伐化：染色體帶型的龐大性和個(gè)別差異決定了核型闡發(fā)不成能全部實(shí)現(xiàn)機(jī)器化，必需依賴履歷富厚的細(xì)胞遺學(xué)家對(duì)核型闡發(fā)軟件得出的效果舉行校正后才氣進(jìn)一步闡發(fā)基因組的不服衡性。因此傳統(tǒng)GH的技能受報(bào)酬因素的限定，必要一定的履歷技能和勞動(dòng)力支持。Array-GH技能中不必要染色體核型的制備和闡發(fā)，與平凡的基因芯片檢測(cè)表達(dá)譜的歷程一樣，其效果完全可以由呆板和盤算機(jī)綜合闡發(fā)后即可得到樣品中大量基因序列及表達(dá)的信息。1.5Array-GH技能的分類根據(jù)微陣列上所固化的核苷酸的性子，Array-GH可分為DNAArray-GH和DNAArray-GH兩種范

9、例。前者以通例的DNA微陣列為平臺(tái)，基因芯片外貌結(jié)實(shí)的探針來(lái)自待測(cè)種屬的DNA文庫(kù)。DNAArray-GH技能使得大范圍、高通量研究基因的改釀成為實(shí)際。DNAArray-GH技能是直接將基因組DNA片斷固化于芯片外貌，因此靶序列上不單有基因編碼區(qū)，還包羅了內(nèi)含子、重復(fù)序列、其他調(diào)控序列等非翻譯區(qū)，增長(zhǎng)了實(shí)行效果的信息量。同時(shí)由于基因組DNA片斷長(zhǎng)于DNA片斷，因此DNAArray-GH的雜交信號(hào)強(qiáng)于DNAArray-GH，進(jìn)步了實(shí)行的敏感度。但DNAArray-GH芯片制備相對(duì)輕易，而DNAArray-GH芯片上普及漫衍的表達(dá)序列標(biāo)簽也有助于所得序列進(jìn)一步純化和點(diǎn)陣。因此這兩種Array-GH

10、技能各有所長(zhǎng)，在實(shí)際事情中可根據(jù)詳細(xì)環(huán)境和實(shí)行要求作出選擇。2Array-GH技能在腫瘤研究中作用Array-GH應(yīng)用超高密度和長(zhǎng)寡核苷酸探針，對(duì)多種腫瘤相干染色體地區(qū)的DNA拷貝數(shù)變革具有較高的區(qū)分率，從而可以尋出基因組的改變，并可精致到基因和外顯子程度的改變；也可以檢測(cè)到很小范疇的基因擴(kuò)增和缺失以及小于500堿基對(duì)的染色體斷點(diǎn)位置。該技能最新希望，Niblegene公司研制的芯片,在一芯片上含有385000個(gè)探針，一次可以闡發(fā)成千上萬(wàn)個(gè)基因組的變革，乃至可以確定相干基因并提供正確的定位1214。2.1乳腺癌2.2肺癌le等20利用Array-GH技能闡發(fā)了14例小細(xì)胞肺癌和27例非小細(xì)胞肺

11、癌基因在各細(xì)胞周期調(diào)治中的作用，創(chuàng)造小細(xì)胞肺癌中RP5基因表達(dá)加強(qiáng)，p38APK活化基因上調(diào)，而在非小細(xì)胞肺癌中表示為DKN2A基因下調(diào)，APK9和EGFR基因上調(diào)。這些信息表白小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌在細(xì)胞周期調(diào)控中有差異的基因調(diào)控機(jī)制。2.3血液及淋巴體系腫瘤已有研究證實(shí)，人類染色體3p在很多實(shí)體瘤中有基因缺失環(huán)境產(chǎn)生，而沒有數(shù)據(jù)表白它在布滿大B細(xì)胞淋巴瘤中有基因缺失環(huán)境產(chǎn)生，Kaeka等21應(yīng)用Array-GH技能對(duì)布滿大B細(xì)胞淋巴瘤舉行研究時(shí)創(chuàng)造，約莫30的布滿大B細(xì)胞淋巴瘤患者的基因在3p14.2上有缺失。全部這些基因缺失被確定在FHITFragileHistidineTriad基因

12、片斷內(nèi)，并表白FHIT基因的缺失是引起基因突變的緣故原由之一。vanVlierberghe等22利用Array-GH技能對(duì)兒童急性T淋巴細(xì)胞白血病舉行研究創(chuàng)造，兒童急性T淋巴細(xì)胞白血病33基因在9q34有擴(kuò)增。而且這個(gè)地區(qū)有4b，內(nèi)含NTH1基因，9q34的擴(kuò)增導(dǎo)致很多基因過表達(dá)，此中包羅RLP41，SSNA1和PHPT1基因的過表達(dá)。只管這些基因的擴(kuò)增和表達(dá)不克不及完全明白與患者的不良預(yù)后有關(guān)，但該基因的復(fù)制標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟著腫瘤細(xì)胞化療后的存活。2.4前線腺癌ihael23及l(fā)ssn等24研究創(chuàng)造PSA基因定位于13q地區(qū)轉(zhuǎn)錄在19號(hào)染色體上，整個(gè)長(zhǎng)度為6kb。他們對(duì)整個(gè)長(zhǎng)度的基因舉行闡發(fā)證實(shí)

13、同系的KLK1、KLK2和HK基因家屬表達(dá)高達(dá)7080。而PSA基因又被稱為KLK3基因。vanDuin等25利用ArrayGH技能創(chuàng)造前線腺癌構(gòu)造或細(xì)胞中8q上有5個(gè)地區(qū)8q21.13(8182b)，8q22.1(9496b)，8q22.23(101103b)，8q24.13(124126b)，和8q24.21(127129b)高頻率的擴(kuò)增，而這些地區(qū)大部門遠(yuǎn)端都有含有Y癌基因。Y和別的地區(qū)的別的13條與癌相干基因在前線腺癌構(gòu)造中用Array-GH法也被檢測(cè)到。尚有前線腺癌異種移植的P339中，通過Array-GH檢測(cè)到8q上高擴(kuò)增的兩條基因。用定量RT-PR檢測(cè)腫瘤構(gòu)造、正常構(gòu)造、前線腺癌

14、細(xì)胞和異體移植的前線腺癌構(gòu)造中這16條基因的表達(dá)，創(chuàng)造這16條中有3條高表達(dá)，這3條基由于，PDP定位于8q22.1(95b)、PABP1定位于8q22.3(102b)和KIAA0196定位于8q24.13(126b)。這些基因被以為是前線腺癌希望的標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟物。2.5其他腫瘤比來(lái)，日本學(xué)者Sait26用Array-GH法對(duì)7個(gè)膽囊癌細(xì)胞系和5個(gè)膽管癌細(xì)胞系的染色體改變舉行了檢測(cè)，效果創(chuàng)造，在7個(gè)膽囊癌細(xì)胞系中，每一個(gè)都可以檢測(cè)到6p21.32擴(kuò)增，均可檢測(cè)到的喪失區(qū)在3p22.3，3p14.2，3p14.3，4q13.1，22q11.21，22q11.23，而在5個(gè)膽管癌細(xì)胞系中，均可檢測(cè)

15、擴(kuò)增的是7p21.1，7p21.2，17q23.2，20q13.2，喪失的在1p36.21，4q25，6q16.1，18q21.31，18q21.33，而擴(kuò)增最大的地區(qū)卻在13q14.3q21.32(約莫11b)，喪失的最大地區(qū)在18q12.2q21.1(約莫15b)，表現(xiàn)出膽囊癌和膽管癌遺傳學(xué)差異。有學(xué)者還利用ArrayGH技能研究了胰腺腫瘤27、宮頸癌28、胃癌29等多種腫瘤，刻畫了相干染色體地區(qū)的DNA拷貝數(shù)及基因變革，富厚了分子生物學(xué)信息。3在腫瘤研究及應(yīng)用中存在的題目因Array-GH可以舉行主動(dòng)化操縱，具有高通量、輕便、正確的特點(diǎn)，故可應(yīng)用于臨床診斷。Array-GH的區(qū)分率高，可以或許創(chuàng)造同一腫瘤差異亞型之間的