分子標記的技術(shù)

1、關(guān)于分子標記技術(shù)第1頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四DNA指紋分析研究是一種重要的分子標記技術(shù)，它包括RFLP（restriction fragment length polymorphism）、RAPD（randomly amplified polymorphic DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism）、SSR（simple sequence repeat）和ISSR（inter-simple sequence repeat）等這些在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的檢測DNA多態(tài)性的分子標記技術(shù)。 第2頁，共90頁，

2、2022年，5月20日，11點13分，星期四 分子標記的優(yōu)越性表現(xiàn)為：（1）分子信息是可遺傳的，而只有在遺傳上可傳遞的屬性才能提供評估系統(tǒng)發(fā)育的信息；（2）數(shù)量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；（3）分子標記能提供共同的尺度；（4）分子數(shù)據(jù)能將從共同祖先遺傳下來的同源性和由于趨同進化從不同祖先演變而來的相似性區(qū)分開來表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達；（5）任何生物有機質(zhì)包括動物、植物和微生物有許多共同的分子屬性，因此分子數(shù)據(jù)可提供共同尺度來直接比較任何有機體任何分類層次之間相對水平的遺傳變異 ；（6）分子標記技術(shù)可應(yīng)用于各個生物門類，并都可用于比較和綜合分析。第3頁，共90頁，2022

3、年，5月20日，11點13分，星期四分子標記的選擇理想的分子標記應(yīng)該符合的標準是：多態(tài)性高；共顯性遺傳，在二倍體生物中能區(qū)分純合與雜合狀態(tài)；在基因組中頻繁出現(xiàn)，甚至貫穿分布于整個基因組；選擇中性；容易獲得；容易操作，自動化程度高；重復(fù)性好；所獲得的數(shù)據(jù)能進行交流和比較。 第4頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四二、蛋白質(zhì)標記在蛋白質(zhì)多態(tài)性研究基礎(chǔ)上發(fā)展起來的分子標記技術(shù)稱為蛋白質(zhì)標記，最常用的技術(shù)是蛋白質(zhì)電泳及與其配套的專一性染色，如曾經(jīng)廣為采用的等位酶分析，是通過同一基因位點上不同等位基因編碼的同種酶的不同分子形式，使得酶譜分析具有相關(guān)的遺傳學意義，酶譜的變化反應(yīng)了等位

4、基因和位點的變化。等位酶技術(shù)為植物的種群遺傳學和進化研究作出了重要的貢獻。但由于等位酶缺乏足夠的變異，在技術(shù)上存在一定的局限性，如今已逐漸被DNA標記所取代。 第5頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四三、DNA分子標記的種類 分子標記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)，大致可分為三大類。 第一類是以分子雜交為核心的分子標記技術(shù)，包括： 限制性片段長度多態(tài)性標記（Restriction fragment length polymorphism, 簡稱RFLP標記）； DNA指紋技術(shù)（DNA Fingerprinting）； 原位雜交（in situ hybridization）等；第

5、6頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 第二類是以聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase chain reaction ,簡稱PCR反應(yīng)）為核心的分子標記技術(shù)，包括： 隨機擴增多態(tài)性DNA標記（Random amplification polymorphism DNA, 簡稱RAPD標記）； 簡單序列重復(fù)標記（Simple sequence repeat, 簡稱SSR標記）或簡單序列長度多態(tài)性（Simple sequence length polymorphism, 簡稱SSLP標記）； 擴展片段長度多態(tài)性標記（Amplified fragment length polym

6、orphism, 簡稱AFLP標記）； 序列標簽位點（Sequence tagged sites, 簡稱STS標記）； 序列特征化擴增區(qū)域（Sequence charactered amplified region, 簡稱SCAR標記）等；第7頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 第三類是一些新型的分子標記，如： 單核苷酸多態(tài)性（Single nuleotide polymorphism, 簡稱SNP標記）； 表達序列標簽（Expressed sequences tags, 簡稱EST標記）等。第8頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四四、分子標記的特

7、點 （1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達與否等問題； （2）數(shù)量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限； （3）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造； （4）表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達； （5）許多標記表現(xiàn)為共顯性的特點，能區(qū)別純合體和雜合體。第9頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 一）限制性片段長度多態(tài)性標記（Restriction fragment length polymorphism, RFLP） 該技術(shù)由Grodzicker等于1974年創(chuàng)立。 由于DNA分子中限制性內(nèi)切酶酶

8、切識別序列中出現(xiàn)堿基的插入、缺失、置換、倒位而導(dǎo)致酶切位點的增減所引起的基因型限制性片段長度的差異。 五、常用的分子標記第一類分子標記以分子雜交為核心的分子標記技術(shù)第10頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四基因組DNA用已知的限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生許多大小不等的DNA片段，電泳分離、Southern印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用放射性標記的探針與膜上變性的酶切DNA進行雜交，放射自顯影，即可顯示出不同材料的多態(tài)性圖譜，即顯示出所分析的DNA序列間的RFLP。 基本原理第11頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四基本步驟： DNA提取用DNA限制性內(nèi)切酶消

9、化 凝膠電泳分離限制性片段 將這些片段按原來的順序和位置轉(zhuǎn)移到易操作的濾膜上 用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標記的DNA作探針與膜上的DNA雜交（稱 Southern雜交） 放射性自顯影或酶學檢測顯示出不同材料對該探針的限制性酶切片段多態(tài)性。 第12頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 動植物生物體由不同的器官和組織構(gòu)成。應(yīng)選用生物體中生長旺盛的器官、組織和細胞提取DNA，如植物幼苗或新長出的葉片、動物的血等。DNA提取的效果由DNA的質(zhì)量和得率來評價。選用適當?shù)纳锲鞴俸徒M織是獲得高質(zhì)量和高得率DNA的保證。取樣后應(yīng)盡快在低溫中保存，長時間保存應(yīng)在超低溫中保存。 生物體樣

10、品的選取第13頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 作為DNA提取的開始，多細胞的生物體樣品首先需要經(jīng)過研磨，使樣品破碎。然后樣品粉末再通過裂解液把細胞裂解。裂解液通常是由Tris Tris（hydroxymethyl）aminomethane，即三羥基甲基氨基甲烷 緩沖液加裂解劑組成，如SDS（Sodium dodecyl sulfate）即十二烷基磺酸鈉、CTAB（Hexadecyltrimethyl ammonium bromide）即十六烷基三甲基溴化銨等。 細胞的裂解第14頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 通常使用能使蛋白質(zhì)變性的試劑，

11、如醋酸鉀、醋酸鈉、氯仿等。 通常使用RNA酶。 蛋白質(zhì)的沉淀RNA的消化第15頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 通常使用冰凍的異丙醇（2-ropanol）、70%乙醇等。 通常使用TE緩沖液（10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0，滅菌）。 EDTA（didodium ethylenediaminetetra-acetate）即乙二胺四乙酸。 DNA沉淀DNA溶解第16頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 電泳用的凝膠由瓊脂糖（agarose）制備，瓊脂糖的濃度通常為0.9-1.0%。 酶切后的DNA樣品通過電泳，使DNA片段分離,并按

12、分子量的大小排列。 電泳第17頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 DNA從凝膠轉(zhuǎn)移到特制的雜交膜上，常用Hybond N+（Amersham） 的尼龍膜。 凝膠的處理： 脫嘌呤處理：0.25M HCl 變性處理：0.4M NaOH DNA轉(zhuǎn)移： 轉(zhuǎn)移液：0.4M NaOH。 洗膜： 洗膜液：2xSSC緩沖液 雜交膜的制備第18頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 用于RFLP分析的探針（probe）是DNA片段，長度約0.5-2.5kb。探針的來源有：基因組的隨機片段、cDNA 等。 探針以克隆的方式保存，以質(zhì)粒（plasmid）為載體，如pUC1

13、9等，通過大腸桿菌繁殖。第19頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 用作載體的質(zhì)粒必須具備三個特性： 一個復(fù)制起始點（Ori）； 一個顯性的選擇標記，如氨芐青霉素（ampicillin）抗性基因（Ampr）； 單一的限制性酶切位點。載體第20頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四第21頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 利用放射性同位素（32P-dCTP）等對探針進行標記，以跟蹤探針。 同位素標記：利用DNA聚合酶（Klenow），在DNA復(fù)制的過程中，把32P-dCTP合成到DNA片段上。 探針的標記(labeling)第22

14、頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 雜交液 + 鮭精DNA ( sheared salmon sperm DNA, SSS DNA ) 雜交液:20 X SSPE 250 ml100 X Denhardts 50 ml10% (w/v) SDS 50 mlMake up to 1000 ml 65C保溫，2小時以上。預(yù)雜交第23頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四A. 2X SSC, 0.1% SDS, 65C, 20 min;B. 1X SSC, 0.1% SDS, 65C, 20 min;C. 0.5X SSC, 0.1% SDS, 65C,

15、20 min 把已標記的探針加入到雜交液中，加入經(jīng)預(yù)雜交的雜交膜。 65C保溫，過夜。雜交洗膜第24頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 用塑料薄膜把已雜交的雜交膜包起來。放入暗盒中。 放入X光片，緊壓。-80 C冷柜中曝光2-4天。 在暗房中取出X光片，顯影、定影、沖冼。包膜照射顯影第25頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 A 無表型效應(yīng)，RFLP標記的檢測不受環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響。B RFLP標記在等位基因之間是共顯性的，因此在配制雜交組合時不受雜交方式的影響。C 在非等位的RFLP標記之間不存在上位效應(yīng)，因而互不干擾。D RFLP標記起源

16、于基因組DNA的自身變異，在數(shù)量上幾乎不受限制。E DNA需要量大，檢測技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實踐中。在植物分子標記輔助育種中需要將RFLP轉(zhuǎn)換成以PCR為基礎(chǔ)的標記。RFLP優(yōu)點 第26頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 但RFLP分析需要比較完善的包括多種酶切、標記、分子雜交等技術(shù)的實驗室，加上工作量大、成本高以及放射性的問題，使其應(yīng)用受到了一定的限制。第27頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四ABAB限制性內(nèi)切酶位點與放射性探針結(jié)合部位限制性內(nèi)切酶酶切后；電泳分離DNA片段；轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜；與放射性探針雜交，分析陽性條帶第28頁

17、，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 一）隨機擴增多態(tài)性（random amplified polymorphism DNA，RAPD） RAPD是1990年由美國杜邦公司的科學家Williams和加利福尼亞生物研究所Welsh幾乎同時發(fā)展起來的建立在PCR基礎(chǔ)上的一種新型的DNA分子標記技術(shù)。第二類分子標記以聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR反應(yīng)）為核心的分子標記技術(shù)第29頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四基本原理 采用隨機合成的寡核苷酸（通常10bp）作PCR反應(yīng)的引物，對所研究生物基因組DNA進行PCR擴增，經(jīng)過3040個循環(huán)，即可得到大量的DNA片段，擴

18、增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、EB染色、紫外下顯示RAPD帶紋。 第30頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四由于整個基因組存在眾多反向重復(fù)序列，因此須對每一隨機引物單獨進行PCR。單一引物與反向重復(fù)序列結(jié)合。使重復(fù)序列之間的區(qū)域得以擴增。引物結(jié)合位點DNA序列的改變以及兩擴增位點之間DNA堿基的缺失、插入或置換均可導(dǎo)致擴增片段數(shù)目和長度的差異，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。若PCR產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生RAPD標記。 第31頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四技術(shù)路線DNA的提取 PCR反應(yīng) 凝膠電泳 選擇隨機引物 圖譜分析 第32頁，共90頁

19、，2022年，5月20日，11點13分，星期四與RFLP的比較相同之處：都從瓊脂糖凝膠上DAN條帶的多態(tài)性來反映基因結(jié)構(gòu)上的多態(tài)性；不同之處：RFLP用限制性內(nèi)切酶消化DNA，通過分析限制性酶切片端的多態(tài)性，來顯示DNA的結(jié)構(gòu)的多態(tài)性；而RAPD是利用PCR技術(shù)從擴增的DNA片段上分析多態(tài)性。由于片段被引物選擇地擴增，并不是所有序列都擴增，擴增了的片斷能在凝膠上清晰地顯現(xiàn)出來，這樣就可以通過同種引物擴增條帶的多態(tài)性，反映出模板的多態(tài)性。第33頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四與常規(guī)PCR的比較常規(guī)PCR需要兩個引物，每個引物分子1530個核苷酸，引物順序根據(jù)擴增的基因兩

20、端的順序設(shè)計，因而要進行PCR時，必需知道待擴增基因的順序；RAPD分析時，只需一個引物，長度10個核苷酸左右，引物順序是隨機的，因而可在對被檢對象無任何分子生物學資料的情況下對其基因組進行分析。第34頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四（1）不需DNA探針，設(shè)計引物也無須知道序列信息；（2）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性），不能鑒別雜合子和純合子；（3）技術(shù)簡便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)；（4）DNA樣品需要量少，引物價格便宜，成本較低；（5）實驗重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。 RAPD標記的主要特點第35頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四RAP

21、D的缺點 RAPD圖譜中某些弱帶重復(fù)性較差，而且目前該法在引物長度和序列及應(yīng)用的引物數(shù)目、擴增反應(yīng)條件等實驗技術(shù)方面未標準化，影響了不同條件下結(jié)果的可比性；每個標記含有的信息量小；有假陽性或假陰性結(jié)果；顯性標記，無法區(qū)分從一個位點擴增的DNA片段是純合的還是雜合的，無法進行等位基因分析。用在種以上類群間的比較時無法得到可靠的遺傳距離。第36頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四二）擴增片段長度多態(tài)性（Amplified restriction fragment polymorphism, AFLP）AFLP是1993年由荷蘭科學家Zabeau等人將PCR與RFLP結(jié)合起來，

22、創(chuàng)造了AFLP分析技術(shù)。 AFLP標記是選擇性擴增基因組DNA酶切片段所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物的多態(tài)性，其實質(zhì)也是顯示限制性內(nèi)切酶酶切片段的長度多態(tài)性，只不過這種多態(tài)性是以擴增片段的長度不同被檢測出來。 第37頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四基本原理首先用限制性內(nèi)切酶酶解基因組DNA，形成許多大小不等的隨機限制性片段；接著在這些片段的兩端連接上特定的寡聚核苷酸接頭（Oligo nuleotide adapter）；然后根據(jù)接頭序列設(shè)計引物，由于限制性片段太多，全部擴增則產(chǎn)物難以在膠上分開，為此在引物的3端加入1-3個選擇性堿基，這樣只有那些能與選擇性堿基配對的片段才能與引物結(jié)

23、合，成為模板被擴增，從而達到對限制性片段進行選擇擴增的目的；最后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，將這些特異性的擴增產(chǎn)物分離開來。 第38頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四第39頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四第40頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四技術(shù)路線（1）首先要制備高分子量(HMW)基因組DNA，選擇6個堿基識別位點的限制性內(nèi)切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。 （2）酶切后的限制性片段在T4連接酶的作用下與特定的接頭相連接，形成帶有接頭的特異性片段。 （3）DNA片段的預(yù)擴增。 （4）在Taq聚合酶的作用下，完

24、成AFLP的選擇性擴增。 （5）PCR產(chǎn)物變性后在含尿素的聚丙烯酰胺變性膠上電泳。 （6）多態(tài)性比較分析，特異片段回收克隆分析。第41頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四AFLP結(jié)合了RFLP與PCR技術(shù)的特點，兼具RFLP和RAPD兩種方法的特長，既繼承了RFLP的穩(wěn)定性，又具有了PCR反應(yīng)快速、靈敏的特點，同時克服了RFLP和RAPD的缺點。采用少數(shù)幾對引物的多種組合即可獲得大量遺傳信息，避免了RAPD分子標記重復(fù)性差、假陽性反應(yīng)過高等不利因素的影響，同時又無需任何目的基因組DNA的背景資料即可完成模板DNA多態(tài)性檢測，擺脫了RFLP的轉(zhuǎn)膜、克隆、探針制備、分子雜交等

25、一系列繁重且又有一定難度的工作 。第42頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四用AFLP分析的多態(tài)性是典型的孟德爾式遺傳和選擇中性。它可以用于遺傳分析的各個方面：如用于擬南芥屬連鎖圖的構(gòu)建用于馬鈴薯的栽培種的鑒定等。AFLP也適于鑒定遺傳多樣性的物種親緣關(guān)系的研究 。第43頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 （1）由于AFLP分析可以采用的限制性內(nèi)切酶及選擇性堿基種類、數(shù)目很多，所以該技術(shù)所產(chǎn)生的標記數(shù)目是無限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反應(yīng)產(chǎn)物的譜帶在50-100條之間，所以一次分析可以同時檢測到多個座位，且多態(tài)性極高；（3）表現(xiàn)共顯性，呈

26、典型孟德爾式遺傳；（4）分辯率高，結(jié)果可靠；（5）目前該技術(shù)受專利保護，用于分析的試劑盒昂貴，實驗條件要求較高。 AFLP特點第44頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四專利技術(shù)，試劑盒價格貴需要同位素或非同位素標記引物，須具特殊防護措施、配套儀器設(shè)備基因組的不完全酶切會影響實驗結(jié)果，所以實驗對DNA純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較高。缺點第45頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四應(yīng)用 AFLP具有可靠性好，重復(fù)性強，可信度高等優(yōu)點，近年來廣泛應(yīng)用于遺傳育種研究，在動物遺傳育種、動物基因組研究中有著廣泛的應(yīng)用前景。構(gòu)建遺傳連鎖圖譜 利用AFLP快速鑒別與目的基

27、因緊密連鎖的分子標記 AFLP輔助的輪回選擇育種 利用AFLP技術(shù)研究基因表達與調(diào)控 分類和進化研究 甲基化研究第46頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四在AFLP技術(shù)的基礎(chǔ)上又發(fā)展了一種新的分子標記TE2AFLP(三內(nèi)切酶擴增的限制片段長度多態(tài)性, three endonuclease amplified fragment length polymorphism) . 該技術(shù)是由荷蘭科學家Vander Wurff 等在2000 年末發(fā)表的. TE2AFLP也是首先擴增限制性內(nèi)切酶片段,然后在高分辨率凝膠(通常為序列分析膠) 上電泳分離這些擴增的片段,再根據(jù)這些片段的長度

28、來檢測DNA多態(tài)性。 與AFLP不同的是要用2 種低頻率切點內(nèi)切酶和1 種高頻率切點內(nèi)切酶混合酶切基因組DNA. TE2AFLP保留和發(fā)展了AFLP的優(yōu)點,克服了AFLP 常見的缺點,具有可靠、快速和方便的特點. 因此,它將廣泛地被應(yīng)用。第47頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四三）簡單序列重復(fù)標記（simple sequence repeat，SSR）又稱微衛(wèi)星DNA(Micro-satellite DNA)標記；屬高度重復(fù)序列，重復(fù)單元26bp，如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重復(fù)，重復(fù)區(qū)大多幾十幾百bp，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具有較高的多態(tài)性

29、。呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了萬余個位點。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG第48頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 由Moore等于1991年創(chuàng)立。SSR即微衛(wèi)星DNA，廣泛分布于基因組的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重復(fù)。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致了SSR長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)這兩端的序列設(shè)計一

30、對特異引物，通過PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴增出來，利用電泳分析技術(shù)就可獲得其長度多態(tài)性，即SSR標記。 原理第49頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 微衛(wèi)星DNA一般位于內(nèi)含子中，因此它在進化過程中受到選擇壓力較小，與其他分子標記相比，微衛(wèi)星在多態(tài)性，群體平均雜合度，以及群體間遺傳距離等方面，微衛(wèi)星位點值均高于蛋白質(zhì)位點，用微衛(wèi)星作為遺傳標記更適合于這些方面的分析，同樣也更適于檢測個體間的差異，微衛(wèi)星DNA為共顯性遺傳，利用PCR及電泳檢測相對容易，也更便于實現(xiàn)自動化，可通過計算雜合度，較好的進行個體鑒定。第50頁，共90頁，2022年，5月20日，11點

31、13分，星期四 建立DNA文庫，篩選鑒定微衛(wèi)星DNA克隆，然后測定這些克隆的側(cè)翼序列，設(shè)計特異性引物來擴增SSR序列。后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色，通過比較譜帶的相對遷移距離，便可知不同個體在某個SSR座位上的多態(tài)性。 技術(shù)路線第51頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 （1）數(shù)量幾乎無限，檢測出多態(tài)性的頻率極高； （2）SSR技術(shù)一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點； （3）SSR標記為共顯性標記，可鑒別出雜合子和純合子； （ 4）結(jié)果重復(fù)性高，穩(wěn)定可靠。為了提高分辨力，通常使用可檢測出單拷貝差異的聚丙烯酰胺凝膠電泳； （5）兼具PCR反應(yīng)的優(yōu)點，即所需DNA樣品量少

32、，對DNA質(zhì)量要求亦不苛刻。優(yōu)點 必須事先知道微衛(wèi)星兩翼序列信息才能設(shè)計引物，對于許多物種需要構(gòu)建文庫。 這將給微衛(wèi)星標記的開發(fā)帶來一定的困難。缺點第52頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四應(yīng)用SSR標記在數(shù)據(jù)上比前述分子標記能顯示出更多的多態(tài)性，已在遺傳疾病的診斷、構(gòu)建遺傳圖譜、種質(zhì)資源鑒定、基因定位及分子標記輔助育種、植物生態(tài)學和系統(tǒng)與進化研究等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用 。微衛(wèi)星DNA PCR擴增結(jié)果（示例）500bp400bp300bp240bp 該結(jié)果顯示在所檢查的人群中，該位點多態(tài)性有四種。第53頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四四）微衛(wèi)星間

33、隔（Inter simple sequence repeat，ISSR） Zietkiewicz et al.(1994) 對SSR技術(shù)進行了發(fā)展，他們用加錨微衛(wèi)星寡核苷酸作引物，對基因組節(jié)段而不是重復(fù)序列本身進行擴增。在SSR的5端或3端加上24個隨機選擇的核苷酸，這可引起特點位點退火。這樣就能導(dǎo)致位于反向排列的間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段進行PCR擴增。這類標記又被稱為ISSR (inter-simple sequence repeat)。 第54頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四基本原理用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3端或5端加上2-4個隨機核

34、昔酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可引起特定位點退火，導(dǎo)致與錨定引物互補的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進行PCR擴增。所擴增的inter SSR區(qū)域的多個條帶通過聚丙烯酞胺凝膠電泳得以分辨，擴增譜帶多為顯性表現(xiàn)。第55頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四ISSR引物的開發(fā)不像SSR引物那樣需測序獲得SSR兩側(cè)的單拷貝序列，開發(fā)費用降低。與SSR標記相比，ISSR引物可以在不同的物種間通用，不像SSR標記一樣具有較強的種特異性;與RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多態(tài)性較高，可獲得幾倍于RAPD的信息量，精確度幾乎可與RFLP相媲美，檢測非常方便，因而是一種非常有發(fā)展前

35、途的分子標記。 第56頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四目前，ISSR標記已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進化及分子生態(tài)學研究中。但是由于不知道目的基因組DNA的背景資料，有一些ISSR引物可能在特定基因組DNA中沒有配對區(qū)域而無擴增產(chǎn)物。而且ISSR也是一種顯性標記，模板濃度需要較一致，最適反應(yīng)條件需要一定時間摸索。 第57頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四ISSR與RAPD技術(shù)很相似，引物和鎂離子濃度以及退火溫度明顯地影響擴增帶的式樣，Taq聚合酶的活性也會影響PCR擴增結(jié)果。一般來講所研究的基因組DNA越復(fù)雜，重復(fù)

36、序列的密度越高，對引物的專一性要求就越高，運行PCR的條件也越嚴格。ISSR引物對Mg2+ 濃度的敏感度大于RAPD，由于引物與模板的雙鏈雜交體的解鏈與退火溫度受二價陽離子的影響；游離的Mg2+ 用來增強DNA聚合酶的活性，它也可與dNTP中磷酸基結(jié)合，而Mg2+ 和dNTP在PCR擴增過程中相互作用，只有Mg2+ 和dNTP的濃度在合適范圍內(nèi)，才能得到好的PCR擴增結(jié)果。 第58頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四在PCR擴增反應(yīng)中，退火溫度的影響最大。一般在運行ISSRPCR時，采用4852退火溫度都能得到好的擴增帶。Virk et al的研究中退火溫度控制在3959

37、之間也能擴增出好的帶譜。但不同的引物在不同的物種中所需的退火溫度是不同的，對ISSR引物來說，可適當提高其退火溫度得到穩(wěn)定清晰的帶譜。第59頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 a.引物 PCR結(jié)果的特異性取決于引物的特異性，擴增產(chǎn)物的大小也是由特異引物限定的。因此，PCR所用引物質(zhì)量要高，且需純化。PCR反應(yīng)中引物的量也影響PCR擴增效果，當PCR引物量太低，則產(chǎn)物量降低，會出現(xiàn)假陰性。引物濃度過高會促進引物的錯誤引導(dǎo)非特異產(chǎn)物合成，還會增加引物二聚體的形成。 PCR反應(yīng)條件PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+第60頁，

38、共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 b. 酶 該酶的最適溫度很高（79），使引物在高溫下進行退火和延伸，這樣便增加了反應(yīng)的總強度并減少了與錯配引物的延伸。在PCR反應(yīng)中，每100l反應(yīng)液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶為佳，酶的濃度太低會使擴增產(chǎn)物產(chǎn)量降低，如果酶的濃度太高則會出現(xiàn)非特異性擴增。Taq DNA聚合酶保存不當而失活是PCR實驗失敗的常見原因。 第61頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 c. d NTP 四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反應(yīng)中dNTP含量太低，PCR擴增產(chǎn)量太

39、少、易出現(xiàn)假陰性。過高的dNTP濃度會導(dǎo)致聚合將其錯誤摻入，因此應(yīng)當避免。 第62頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 d. 模板 PCR可以以DNA或RNA為模板進行核酸的體外擴增。不過RNA的擴增首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進行PCR循環(huán)。不同來源的核酸標本必須經(jīng)處理后才能用于PCR的擴增，處理不當或處理過程中DNA掉失都會導(dǎo)致PCR擴增失敗。采集標本方法不當，未能獲得所要檢測的靶DNA都會導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性。但是如果待擴增標本中模板DNA濃度太高也會導(dǎo)致擴增失敗。 第63頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 e. Mg2+ Mg2+濃度直接影響著酶的

40、活性與忠實性，這是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它還影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，產(chǎn)物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，通常會導(dǎo)致非特異性擴增產(chǎn)物的累積。 第64頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 1. 分子遺傳圖譜的構(gòu)建 目前幾乎所有重要農(nóng)作物，如擬南芥、番茄、玉米、水稻、甜菜、小麥、大豆、馬鈴薯、棉花、油菜等的RFLP圖譜均已構(gòu)成，隨著多種標記的不斷添加與定位，分子遺傳圖譜正日漸趨于飽和。 遺傳圖譜對于基因定位至關(guān)重要，圖譜上包括的標記數(shù)越多，分布越均勻，則基因定位就越精細。高密度分子遺傳圖譜的繪制使一

41、些植物的遺傳學研究取得了重大進展，并對分子標記輔助育種選擇技術(shù)和基因圖位克隆技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動作用。 第一、二類分子標記的應(yīng)用第65頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 2. 遺傳多樣性與種質(zhì)鑒定 分子標記廣泛存在于基因組DNA的各個區(qū)域，數(shù)量巨大，通過對隨機分布于整個基因組的分子標記的多態(tài)性進行比較，就能夠全面評估研究對象的多樣性，并揭示其遺傳本質(zhì)。利用遺傳多樣性的結(jié)果可以對種質(zhì)進行聚類分析，進而了解其系統(tǒng)發(fā)育與親緣關(guān)系。而以分子標記為基礎(chǔ)的比較基因組研究則有利于探明近緣物種間的遺傳同源性以及物種起源等生命科學領(lǐng)域中的重要問題。 第66頁，共90頁，2022年，

42、5月20日，11點13分，星期四微衛(wèi)星標記等具有很高的多態(tài)性，可以用于鑒別同一物種的不同基因型，如Olufowote等選擇4個SSR標記即可有效地評估栽培稻內(nèi)不同品種間的異質(zhì)性；Guifford等用3個SSR標記就能區(qū)分21個蘋果品種。分子標記的這一特點還可用于鑒別品種的混雜情況和真假雜種的判斷等。 第67頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 3.重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的定位 基因定位就是確定基因在染色體上的位置及與之相連鎖的分子標記，高密度分子遺傳圖譜的構(gòu)建使基因定位工作變得相對容易。 目前已完成了重要作物大量控制農(nóng)藝性狀表現(xiàn)如抗病性、抗蟲性、育性等的主基因的定位工作，為

43、開展這些基因的分子育種奠定了基礎(chǔ)。 第68頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四尤為重要的是分子標記技術(shù)為呈數(shù)量遺傳、易受環(huán)境條件影響的重要農(nóng)藝性狀的QTL定位提供了有效手段，目前涉及到QTL圖譜繪制及大量復(fù)雜的數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分析、運算工作已有多個配套的計算機軟件被開發(fā)出來。QTL的定位使得控制數(shù)量性狀的多基因被轉(zhuǎn)變成一個個獨立的“主基因”，便于進行遺傳操作，這無疑有利于對產(chǎn)量、生育期等性狀的定向改良。 第69頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 4.分子標記輔助選擇 選擇是育種的重要環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)育種對目標性狀多采用直接選擇的方法，但作物的許多農(nóng)藝性狀不容易

44、觀測或易受環(huán)境影響、表現(xiàn)不穩(wěn)定，直接選擇比較困難。而在完成基因的分子標記定位后，就可以通過連鎖標記對這些性狀進行間接選擇，從而提高它們的選擇效率。 第70頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四與傳統(tǒng)選擇相比，分子標記輔助選擇有許多顯著的優(yōu)點，主要體現(xiàn)在：（1）可以清除同一座位不同等位基因間或不同座位間互作的干擾，消除環(huán)境的影響；（2）在幼苗階段就可以對在成熟期表達的性狀進行鑒定，如果實性狀、雄性不育等；（3）可有效地對表型鑒定十分困難的性狀進行鑒定，如抗病性、根部性狀等；（4）共顯性標記可區(qū)分純合體和雜合體，不需下代再鑒定；（5）可同時對多個性狀進行選擇，開展聚合育種，快速

45、完成對多個目標性狀的同時改良；（6）加速回交育種進程，克服不良性狀連鎖，有利于導(dǎo)入遠緣優(yōu)良基因。 第71頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四將分子標記輔助選擇應(yīng)用于作物改良的實踐中，已取得一些實質(zhì)性進展。如國際水稻所利用與Xa-4，xa-5，xa-13和Xa-21四個抗白葉枯病基因連鎖的STS標記輔助選擇，成功地將這四個基因以不同組合方式聚合在一起，育成了高抗、多抗白葉枯病水稻新品種。 第72頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 5.重要農(nóng)藝性狀的圖位克隆 圖位克隆（Map-based cloning）是近幾年隨著植物分子標記遺傳圖譜的相繼建立和基因

46、分子定位而發(fā)展起來的一種新的基因克隆技術(shù)。利用分子標記輔助的圖位克隆無須事先知道基因的DNA序列，也不用了解基因的表達產(chǎn)物是什么就可以直接克隆基因。 第73頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四一）單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism， SNP)1. 定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。 不同個體間，基因組DNA某部位的單核苷酸的變異。 1996年，Lander報道了用單核苷酸多態(tài)性標記（single nucleotid polymorphism SNP）。是第三代遺傳標記。第

47、三類分子標記技術(shù)以DNA序列分析為核心第74頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每5001000個堿基對中就有1個，估計其總數(shù)可達1700萬個甚至更多。 在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上。總的來說，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(coding sNP,cSNP)比較少，因為在外顯子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。第75頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 SNP與RFLP和STR標記

48、的主要不同之處在于，它不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標記。第76頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四第77頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四SNP的優(yōu)點(1) SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計出來。(2)它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標記廣泛得多。(3)與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點相比，SNP是高度穩(wěn)定的，尤其是處于編碼區(qū)的SNP(cSNP),而前者的高突變率容易引起對人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。(4)部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達水平，因此，它們本身可能就是疾病遺

49、傳機制的候選改變位點。(5)易于進行自動化分析，縮短了研究時間。第78頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 日本研究人員最近經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，與糖尿病有關(guān)的基因并不是千篇一律，它們之間存在著個人差別，即“單核苷酸多態(tài)性”（SNP）。 第79頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 EST是cDNA的部分序列，平均長度為300500bp，由大規(guī)模cDNA克隆一次測序得到，因此稱作表達序列標簽。通常是從已有的cDNA文庫中隨機取出幾百到幾千個克隆一次測序產(chǎn)生。一般使用載體多克隆位點互補序列作為通用引物。一個EST代表生物體某種組織某一時期的一個表達基因。 EST

50、目前主要被用于尋找新基因和了解基因表達概況。 二）表達序列標簽（expressed sequence tag， EST ）第80頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 一般步驟如下： 建立組織或細胞的cDNA文庫從文庫中隨機取出足夠量的cDNA克隆進行自動測序生物信息學分析（即將所得的EST數(shù)據(jù)與dbEST等數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)比較，確定哪些代表已知基因、哪些代表未知基因） 進一步分析未知基因或歸類分析全部EST以獲得組織或細胞的基因表達概況。 第81頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 SRAP是一種新型的基于PCR的標記系統(tǒng)，由美國加州大學蔬菜作物系Li與

51、Quiros博士于2001年提出，又叫基于序列擴增多態(tài)性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP）。 三）相關(guān)序列擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)第82頁，共90頁，2022年，5月20日，11點13分，星期四 引物設(shè)計是SRAP分析的核心。SRAP標記分析共有兩套引物。在一組正向SRAP引物中使用“CCGG”序列，其目的是使之特異結(jié)合可譯框（ORFs）區(qū)域中的外顯子。運用CCGG序列就可特異擴增出包含這些組分的序列。 由于外顯子序列在不同個體中通常是保守的，這種低水平多態(tài)性限制了將它們做為標記的來源。由于內(nèi)含子、啟動子和間隔序列在不同物種甚至不同個體間變異很大，富含AT的區(qū)域序列