微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用

1、微生物轉(zhuǎn)化技能在當(dāng)代醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用【關(guān)鍵詞】微生物轉(zhuǎn)化技能；,生物催化；,關(guān)鍵中央體摘要：對(duì)微生物轉(zhuǎn)化技能在當(dāng)代醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)應(yīng)用上的奇特上風(fēng)，特別是在手性藥物或藥物中央體制備、借助微生物轉(zhuǎn)化本領(lǐng)實(shí)行組合生物催化在新藥挑選方面發(fā)揮的積極作用舉行了闡述闡發(fā)，并結(jié)互助者自身比年來在該技能范疇的理論和勞績(jī)對(duì)數(shù)個(gè)相干課題作了先容。關(guān)鍵詞：微生物轉(zhuǎn)化技能；生物催化；關(guān)鍵中央體AppliatinfirbialtransfratinindernpharaeutialindustryKEYRDSirbialtransfratin;Biatalysis;Keyinterediates1概述在已往的30多年中，微生物

2、轉(zhuǎn)化或酶轉(zhuǎn)化技能在有機(jī)化學(xué)合成范疇中的實(shí)行不但使理論研究得到普及開展，在現(xiàn)實(shí)應(yīng)用方面也獲得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。很多化學(xué)合成工藝相稱龐大的藥物、食品添加劑、維生素、化裝品和別的一些精致化工產(chǎn)物合成歷程中的某些緊張反響，如今已經(jīng)可以或許用微生物或酶轉(zhuǎn)化技能得以交換。在很多外洋文獻(xiàn)中常常可以或許看到的形貌這種技能的名詞有：irbialtransfratin、irbialnversin、bitransfratin、bitransnversin和enzyatin等1，2。微生物轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是某種微生物將一種物質(zhì)(底物)轉(zhuǎn)化成為另一種物質(zhì)(產(chǎn)物)的歷程，這一歷程是由某種微生物產(chǎn)生的一種或幾種特別的胞外或胞內(nèi)酶作為

3、生物催化劑舉行的一種或幾種化學(xué)反響，簡(jiǎn)言之，即為一種利用微生物酶或微生物自己的合成技能。這些具有生物催化劑作用的酶大多數(shù)對(duì)其微生物的生命歷程也是必須的，但在微生物轉(zhuǎn)化歷程中，這些酶僅作為生物催化劑用于化學(xué)反響。由于微生物產(chǎn)生的這些可以或許被用于化學(xué)反響的大多數(shù)生物催化劑不但可以或許利用自身的底物及其雷同物，且偶然對(duì)外源添加的底物也具有同樣的催化作用，即能催化非自然的反響(unnaturalreatins)，因此微生物轉(zhuǎn)化可以以為是有機(jī)化學(xué)反響中的一個(gè)特別的分支。某種特別的微生物可以或許將某種特定的底物轉(zhuǎn)化成為某種特定的產(chǎn)物，其本質(zhì)是酶的作用。因此，對(duì)酶轉(zhuǎn)化無(wú)需多作說明，它與微生物轉(zhuǎn)化的差異僅在

4、于：前者是一個(gè)單一的酶催化的化學(xué)反響，此后者為了實(shí)現(xiàn)這一酶催化反響，必要為微生物提供一個(gè)可以或許生物合成這些酶的條件，因此，從這一角度來看，這好似是真正的生物轉(zhuǎn)化。別的，只管用于生物轉(zhuǎn)化的酶大多來自于微生物，但也可以是來自于動(dòng)物和植物的酶。而對(duì)付一個(gè)詳細(xì)的生物轉(zhuǎn)化來說，畢竟是接納微生物轉(zhuǎn)化技能，照舊接納酶轉(zhuǎn)化技能，這要綜合思量實(shí)現(xiàn)這一歷程的諸多因素，如本錢、環(huán)境、技能裝備和質(zhì)量要求等。在研究一個(gè)微生物(或酶)轉(zhuǎn)化歷程時(shí)，必要細(xì)致地思量諸多方面的題目如：所用轉(zhuǎn)化底物的選擇、所用微生物對(duì)差異底物轉(zhuǎn)化本領(lǐng)的觀察、轉(zhuǎn)化途徑或轉(zhuǎn)化反響的選擇等。此中最重要的是探求得當(dāng)于所方案轉(zhuǎn)化歷程的微生物，以及怎樣來進(jìn)

5、步這種微生物的轉(zhuǎn)化本領(lǐng)，即進(jìn)步這種酶活力。再那么是創(chuàng)造一種新的酶或一種新的反響以便為方案一個(gè)新的微生物轉(zhuǎn)化歷程提供一條線索。為了探求可以或許適互助為生物催化劑的微生物酶，除了有需要對(duì)本來的一些緊張的酶或反響舉行重新評(píng)價(jià)外，一種更為有用的要領(lǐng)是挑選新的微生物菌株或酶36。用于微生物轉(zhuǎn)化的菌株或酶的挑選的范疇?wèi)?yīng)該盡大概地廣，由于至如今為止已經(jīng)創(chuàng)造了3000余種可以或許催化種種化學(xué)反響的酶，此中有些酶的催化結(jié)果比化學(xué)催化劑好；別的，微生物的多樣性和其生理生化特性的多樣性(它們可以或許修飾和落解許很多多有機(jī)化合物)，使我們有大概尋到某種微生物或酶來催化某種特定的和所盼望的化學(xué)反響。2生物轉(zhuǎn)化與藥物開拓

6、的應(yīng)用愈來愈多的研究表白，作為治療用藥物的外消旋體混淆物有著不成制止的缺點(diǎn)，而美國(guó)FDA宣布的手性藥物引導(dǎo)原那么無(wú)疑加速了重新開始開拓單一異構(gòu)體藥物或利用外消旋體轉(zhuǎn)換技能從已有的藥物中開拓單一異構(gòu)體藥物的步調(diào)。手性藥物制備的關(guān)鍵技能是不合錯(cuò)誤稱合成技能。多年來，有機(jī)化學(xué)事情者已經(jīng)研究開拓了很多種用化學(xué)的要領(lǐng)舉行不合錯(cuò)誤稱合成的技能，但近20多年來，很多恒久從事化學(xué)合成研究的事情者對(duì)微生物和酶反響產(chǎn)生了愛好，與此同時(shí)，很多恒久從事微生物和酶的研究的事情者對(duì)怎樣將此應(yīng)用于有機(jī)合成產(chǎn)生了愛好，從而使生物催化轉(zhuǎn)化(biatalytitransfratin)成為一種舉行不合錯(cuò)誤稱合成的緊張技能。應(yīng)用生物

7、催化轉(zhuǎn)化技能舉行不合錯(cuò)誤稱合成與化學(xué)合成法比擬力具有的良好性有：1)轉(zhuǎn)化底物某一基團(tuán)的埋頭性強(qiáng)，即對(duì)不必要轉(zhuǎn)化的基團(tuán)無(wú)需庇護(hù)；2)通過對(duì)用于某一轉(zhuǎn)化的微生物舉行菌種選育和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，可以得到極高的轉(zhuǎn)化率；3)生物催化轉(zhuǎn)化的反響條件暖和且對(duì)環(huán)境的污染很校特別是比年來DNA重組技能的應(yīng)用和新的轉(zhuǎn)化體系的開拓應(yīng)用，使愈來愈多的本來利用化學(xué)要領(lǐng)舉行不合錯(cuò)誤稱合成的化合物有大概被生物催化轉(zhuǎn)化的要領(lǐng)來交換710。利用生物轉(zhuǎn)化技能舉行手性藥物的開拓重要舉行兩個(gè)方面的事情：一是舉行藥物關(guān)鍵中央體的制備，由于利用生物催化轉(zhuǎn)化要領(lǐng)制備對(duì)映體純化合物(enantipurepunds)具有很大的吸引力，但試圖利用

8、這種要領(lǐng)來完成所盼望的龐大的有機(jī)合成每每是困難的，乃至是不成能的，而利用這種要領(lǐng)得到某一關(guān)鍵中央體是實(shí)在可行的；別的，只管用化學(xué)的要領(lǐng)可以或許在實(shí)行室條件下得到所必要的手性藥物，但每每是由于本錢和技能題目難以實(shí)現(xiàn)財(cái)產(chǎn)化。因此用化門生物化學(xué)的制備途徑具有奇特的良好性，即所謂的“綠色合成工藝；二是舉行消旋化合物的生物拆分或轉(zhuǎn)化，得到單一構(gòu)型的藥物分子。表1為一些利用生物轉(zhuǎn)化制備手性藥物或關(guān)鍵中央體的實(shí)例11。3組合生物催化與新藥創(chuàng)造組合生物轉(zhuǎn)化(催化)(binatrialbiatalysis)，是指利用一種以上的具有特別轉(zhuǎn)化成效的微生物或酶，對(duì)同一個(gè)母體化合物舉行組合轉(zhuǎn)化，以得到化學(xué)布局的多樣性，

9、它是從化合物中探求新型衍生物以及從簡(jiǎn)樸化合物制備龐大化合物的有用本領(lǐng)。從某種角度講，它比化學(xué)合成的要領(lǐng)更為簡(jiǎn)樸和有用。這是一個(gè)新的研究范疇。自然產(chǎn)物的多樣性和其布局的龐大性，是存在于生物體內(nèi)大量酶的作用結(jié)果。生物體內(nèi)賣力一系列緊張生命運(yùn)動(dòng)的酶，在體外同樣具有雷同的催化本領(lǐng)。因此，只要體外的催化環(huán)境與體內(nèi)相仿，那么可以或許實(shí)現(xiàn)一系列龐大的，特別是用傳統(tǒng)化學(xué)合成要領(lǐng)難以實(shí)現(xiàn)的化學(xué)反響。利用生物催化劑或化學(xué)合成酶催化相結(jié)合的要領(lǐng)，可以或許大大地增長(zhǎng)衍生物的多樣性，以及可以或許有用地對(duì)龐大自然產(chǎn)物的結(jié)果修飾和從簡(jiǎn)樸的分子構(gòu)建新的化合物庫(kù)，在這歷程中，每每可以或許創(chuàng)造新的生理活性物質(zhì)。生物催化劑為擴(kuò)大組

10、合化學(xué)提供了種種合成的大概性1，1113。表2為一些由酶或微生物催化的典范反響。利用生物催化創(chuàng)造先導(dǎo)化合物的良好性在于：1)大概舉行反響的范疇廣；2)可以或許定向舉行地區(qū)選擇性和立體選擇性；3)不需基團(tuán)庇護(hù)和脫庇護(hù)，一步實(shí)現(xiàn)所需的反響；4)在暖和和均一的條件下可輕易地實(shí)現(xiàn)主動(dòng)化和一步反響的重現(xiàn)性；5)暖和的反響條件包管了龐大易變的分子布局的不變性；6)高的催化活性可以低落催化劑的用量；7)酶的結(jié)實(shí)化可以使催化劑重復(fù)和循環(huán)利用；8)生物催化劑可在環(huán)境中完全被落解。4比年來本中央開展的一些相干課題的希望比年來，上海來益生物藥物研究開拓中央開始涉及微生物轉(zhuǎn)化課題的研究，特別是用微生物舉行植物甾醇邊鏈

11、落解制備甾體藥物關(guān)鍵中央體的開拓以及抗糖尿病新藥米格列醇和伏格列波糖的開拓。表1利用生物轉(zhuǎn)化制備手性藥物或關(guān)鍵中央體的部門實(shí)例略4.1甾體類微生物轉(zhuǎn)化的研究甾體藥物包羅激素類藥物和非激素類藥物：前者如性激素、類皮質(zhì)激素和卵白同化激素等；后者有抗細(xì)菌和抗腫瘤藥物等。由于其不成代替的用途及治療順應(yīng)證不竭擴(kuò)大，甾體藥物越來越引起人們的器重。利用生物轉(zhuǎn)化技能舉行甾體藥物消費(fèi)重要有植物甾醇的邊鏈切除，以得到關(guān)鍵中央體ADD和4AD，以及舉行立體選擇性的羥化反響。(1)利用微生物轉(zhuǎn)化切除邊鏈，制備甾體藥物關(guān)鍵中央體ADD和4AD微生物對(duì)甾體邊鏈的裂解轉(zhuǎn)化是一個(gè)很慢的歷程，由于底物和產(chǎn)物的溶解性都很差，且底

12、物通報(bào)至細(xì)胞的歷程和產(chǎn)物傳出細(xì)胞的歷程都很慢。因此，怎樣進(jìn)步底物的溶解性不停是進(jìn)步微生物轉(zhuǎn)化率的緊張步調(diào)。我們?cè)谖⑸镛D(zhuǎn)化菌株的菌種選育、轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化和轉(zhuǎn)化體系的研究方面舉行了數(shù)年的研究事情1417，終極已經(jīng)得到了具有財(cái)產(chǎn)化代價(jià)的微生物轉(zhuǎn)化技能，即以自然維生素E消費(fèi)下足料(含有混淆植物甾醇)為底物制備甾體藥物關(guān)鍵中央體ADD和4AD的產(chǎn)業(yè)化途徑。圖1所示為混淆植物甾醇底物和ADD以及4AD的化學(xué)布局。(2)利用微生物轉(zhuǎn)化選擇性羥基化，制備甾體藥物關(guān)鍵中央體11HADD、11H4AD，以及抗心衰新藥依普利酮關(guān)鍵中央體11H坎利酮我們別離舉行了以ADD、4AD以及坎利酮為底物的微生物轉(zhuǎn)化菌株的篩

13、癬選育，以及轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化等大量研究事情，終極得到了具有財(cái)產(chǎn)化代價(jià)的微生物轉(zhuǎn)化制備工藝。圖2所示為11HADD和11H4AD的化學(xué)布局。圖3所示為從坎利酮到11H坎利酮的微生物轉(zhuǎn)化。(3)利用微生物轉(zhuǎn)化技能，得到多種4AD布局雷同物很多甾體藥物的關(guān)鍵中央體與4AD的布局雷同物有關(guān)，我們挑選了多種具有差異特性的微生物菌株對(duì)4AD舉行轉(zhuǎn)化，結(jié)果得到了一系列的4AD布局雷同物，如圖4所示18。(4)利用微生物轉(zhuǎn)化技能，從植物混淆甾醇直接消費(fèi)睪酮在我們多年對(duì)植物甾醇微生物轉(zhuǎn)化邊鏈切除的研究歷程中，創(chuàng)造了一個(gè)非常成心義的征象：即在顛末誘變處置懲罰的大量微生物轉(zhuǎn)化菌種中，創(chuàng)造了一株可以或許直接將植物甾醇轉(zhuǎn)

14、化成睪酮的菌株19。同時(shí)，轉(zhuǎn)化條件的改變可以或許使睪酮的轉(zhuǎn)化率大大地進(jìn)步。進(jìn)一步的研究表白，可以或許將植物甾醇直接轉(zhuǎn)化成大量睪酮的微生物菌株，其17羰基復(fù)原酶的活性比力高，因此將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的ADD和4AD中17位的羰基復(fù)原成為羥基，別離得到睪酮和去氫睪酮，以及別的一個(gè)17位邊鏈產(chǎn)生改變的布局雷同物，如圖5所示。顛末大量的菌種選育事情和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化事情，已經(jīng)得到了一條利用微生物轉(zhuǎn)化直接從混淆植物甾醇制備睪酮的產(chǎn)業(yè)化工藝途徑。圖1底物混淆植物甾醇和產(chǎn)物ADD以及4AD的化學(xué)布局略圖211HADD和11H4AD的化學(xué)布局略圖3從坎利酮到11H坎利酮的微生物轉(zhuǎn)化略圖4利用微生物轉(zhuǎn)化4AD得到的一系列布

15、局雷同物略圖5睪酮和去氫睪酮的化學(xué)布局略4.2落糖藥物米格列醇的研究開拓米格列醇(iglitl)的創(chuàng)造源于對(duì)微生物發(fā)酵產(chǎn)物野尻霉素的研究，研究表現(xiàn)該本來作為抗沙門氏菌的抗生素具有較強(qiáng)的葡萄糖苷酶按捺作用，繼而成為第一個(gè)具有開拓代價(jià)的淀粉酶按捺劑。1脫氧野尻霉素(1dexynjiriyin)由野尻霉素復(fù)原而得，也可由多種鏈霉菌和芽孢桿菌產(chǎn)生，同樣具有糖苷酶按捺作用。N代替1脫氧野尻霉素具有更好的落糖結(jié)果，米格列醇就是此中之一。米格列醇的布局與葡萄糖相似，可以或容許逆地競(jìng)爭(zhēng)性按捺假單糖葡糖苷酶，淘汰單糖的代謝，低落在小腸的汲取。圖6所示為葡萄糖、1脫氧野尻霉素和米格列醇的化學(xué)布局。按照文獻(xiàn)報(bào)道，有

16、多種制備米格列醇的化學(xué)合成工藝。此中有以6脫氧6氨基山梨醇為質(zhì)料，經(jīng)雷尼鎳催化復(fù)原后，再與環(huán)氧乙烷反響而成。也可以先與環(huán)氧乙烷反響后，再在鈀碳催化下復(fù)原制得。別的，也有多種利用生物轉(zhuǎn)化和化學(xué)合成相結(jié)合的要領(lǐng)，以及先用微生物發(fā)酵制備野尻霉素或1脫氧野尻霉素后再用化學(xué)合成的要領(lǐng)來制備米格列醇20。本中央研究開拓的米格列醇制備工藝接納生物轉(zhuǎn)化與化學(xué)合成相結(jié)合的要領(lǐng)，扼要工藝流程如圖7所示。本制備工藝的關(guān)鍵是挑選具有高效氧化氨基葡萄糖的微生物菌株，以及可以或許實(shí)現(xiàn)財(cái)產(chǎn)化的轉(zhuǎn)化工藝。4.3落糖藥物伏格列波糖的研究開拓伏格列波糖(vglibse)是新一代的葡糖苷酶按捺劑，最初是從某種放線菌造就液中創(chuàng)造的氨

17、基糖雷同物，口服后能競(jìng)爭(zhēng)拮抗性地按捺腸道內(nèi)雙糖類水解酶(葡糖苷酶)，延緩糖尿病患者餐后血糖的敏捷上升從而按捺餐后高血糖。同時(shí)伏格列波糖顯著低落身材的脂肪量，胖胖的減輕使胰島素受體敏感性增長(zhǎng)，進(jìn)而使空腹血糖漸漸顯著落落。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，伏格列波糖的制備除了通過全化學(xué)合成得到外，另有以下幾條途徑：一條途徑是由有用霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵，從發(fā)酵液中分散出大組分有用霉素A，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后得到關(guān)鍵中央體valienaine和validaine，再顛末化學(xué)合成即可得到終產(chǎn)物；或是從有用霉素發(fā)酵液中分散出小組分有用霉素G，生物轉(zhuǎn)化得到關(guān)鍵中央體valienaine和valilaine，兩者經(jīng)得當(dāng)步調(diào)的化學(xué)合成反響后即可得

18、到終產(chǎn)物；第二條途徑是從有用霉素發(fā)酵液中分散出小組分valienaine，經(jīng)化學(xué)合成后得到終產(chǎn)物；第三條途徑是從有用霉素發(fā)酵液中分散出小組分valilne，同樣經(jīng)得當(dāng)化學(xué)合成反響后得到終產(chǎn)物；第四條途徑是由D葡萄糖經(jīng)一系列的化學(xué)反響直接合成得到終產(chǎn)物。其流程如圖8所示。本研究中央利用第一條工藝途徑，挑選得到了具有高轉(zhuǎn)化服從的微生物菌株，以及得當(dāng)產(chǎn)業(yè)化消費(fèi)的轉(zhuǎn)化工藝。圖6米格列醇、野尻霉素及1脫氧野尻霉素、D葡萄糖的化學(xué)布局略圖7米格列醇的制備工藝略4.4N乙酰神經(jīng)氨酸的研究開拓N乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5A)是合成抗病毒藥物扎那米韋的前體，其自己也具有多種緊張的應(yīng)用代價(jià)。如今有三種差異的生物轉(zhuǎn)化要

19、領(lǐng)制備Neu5A(圖9)：途徑是一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)樸的醛縮反響；途徑涉及到反響前體anNA的磷酸化；途徑所合成的產(chǎn)物Neu5A9P必要進(jìn)一步用別的的酶脫磷酸化。這些合成要領(lǐng)均可在體外舉行，如今已經(jīng)用于產(chǎn)業(yè)化消費(fèi)的是途徑。本中央接納途徑的生物轉(zhuǎn)化要領(lǐng)，起首從E.li600中樂成地?cái)U(kuò)增了N乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶基因(nal)，通過同源性比力創(chuàng)造，它與泉源于E.liK12的nal序列完全同等。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表白，136和164位的氨基酸也為賴氨酸和酪氨酸，與文獻(xiàn)報(bào)道的活性中央位點(diǎn)同等。進(jìn)而，將該基因通過ERI和BaHI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，嚴(yán)酷操縱起始暗碼子和啟動(dòng)子間間隔的環(huán)境下克隆到高表達(dá)載體pYG5上，構(gòu)建成新

20、的質(zhì)粒pLY2，并舉行其表達(dá)研究。然后對(duì)粗酶的制備、轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化、闡發(fā)檢測(cè)要領(lǐng)的創(chuàng)立，以及產(chǎn)物的分散純化等舉行了研究，開端得到了一條得當(dāng)產(chǎn)業(yè)化消費(fèi)N乙酰神經(jīng)氨酸的途徑。圖8制備伏格列波糖4條差異工藝途徑略圖9三種差異的生物轉(zhuǎn)化制備Neu5A的要領(lǐng)略參考文獻(xiàn)1DrdiJS,KhelnitskyYL,SergeevaV.TheevlutinfbitransfratintehnlgiesJ.urrpinirbil,1998,1(3):3112HllandHL.irbialtransfratinsJ.urrpinheBil,1998,2(1):773BrnsheuerUT,Phl.Iprvedbia

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