地中海貧血基因檢測系統(tǒng)課件

1、地中海貧血基因檢測系統(tǒng)地中海貧血基因檢測系統(tǒng)地中海貧血基因檢測系統(tǒng)地中海貧血是全球最大的單基因遺傳病之一地中海貧血基因檢測系統(tǒng)地中海貧血基因檢測系統(tǒng)地中海貧血基因檢地中海貧血是全球最大的單基因遺傳病之一地中海貧血是全球最大的單基因遺傳病之一地中海貧血的共同特點是由于珠蛋白基因的缺陷使血紅蛋白中的珠蛋白肽鏈有一種或幾種合成減少或不能合成，致使血紅蛋白的組成成分改變。地中海貧血分為-地中海貧血和-地中海貧血。地中海貧血的共同特點是由于珠蛋白基因的缺陷使血紅蛋白中的珠蛋胚胎期血紅蛋白：Hb Gower 1 （x2 e2 ）Hb Gower 2 (a2 e2)Hb Portland (x2 g2) 即

2、Hb Portland 1另有少量Hb Portland 2 (x2 b2)，Hb Portland 3 (x2 d2)胎兒期主要血紅蛋白：HbF （a2 g2 ） 成人主要血紅蛋白：HbA （ a2 b2）約占血紅蛋白總量96.597.5%HbA2 （a2 d2 ） 約占血紅蛋白總量2.53.5%HbF （ a2 g2）約占血紅蛋白總量1%以下。胚胎期血紅蛋白：a2b2za2a1Chromosome 16Chromosome 11a-globin gene clusterb-globin gene clustereggdbPredominant HaemoglobinEMBRYONICFET

3、ALADULTz2e2a2g2(a2d2)Hemoglobina2b2za2a1Chromosome 16Chromoso -地中海貧血（簡稱-地貧）是一種由于-珠蛋白基因突變導(dǎo)致肽鏈表達(dá)失衡而產(chǎn)生的單基因遺傳血液病。多由-珠蛋白基因的缺失突變所致。研究發(fā)現(xiàn)中國地區(qū)常見的3種 -地貧主要由 -SEA、-3.7、 -4.2缺失(左缺失）引起。-地中海貧血（簡稱-地貧）是一種由于-珠蛋白基因突變導(dǎo)-a3.7-a4.2-SEA a2 a1a2a11-a3.7-a4.2-SEA a2 a1a2a11-地中海貧血是一種由于-珠蛋白基因突變導(dǎo)致肽鏈合成減少或缺乏而產(chǎn)生的單基因遺傳血液病，多由-珠蛋白基因點

4、突變所致。 在中國人群中常見的突變位點有CD41-42M， -28M， IVS-II-654M，CD71-72M等 -地中海貧血是一種由于-珠蛋白基因突變導(dǎo)致肽鏈合成減少或編碼區(qū)的移碼突變、無義突變和起始密碼突變：如CD41-42，CD71-72 ，CD17突變后形成終止子，表現(xiàn)為0。 非編碼區(qū)IVS-1和IVS-2突變?nèi)鏘VS-II-654突變影響mRNA的拼接，表現(xiàn)為。影響轉(zhuǎn)錄的突變：如-28，-29的突變影響基因的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)為 。編碼區(qū)的移碼突變、無義突變和起始密碼突變：地區(qū)攜帶率（） 地貧 地貧廣州8.532.54廣西14.956.78四川1.922.18貴州-4.72臺灣4.201.

5、10香港5.023.41地區(qū)攜帶率（） 地貧 地貧廣州8.532.54廣西14基因變異頻率(%)基因變異頻率(%)a 地貧8.53b 地貧2.54-SEA4.14CD41-420.92-a3.73.10IVS-2-6540.63-a4.20.95-280.42-aCS0.18CD260.13-THAL0.04CD170.10-aQS0.04CD71-720.09-11.10.02CD430.09a1CD118(+TCA)0.02-290.05-a-gene缺失0.02CD27-280.05未知突變0.04b-gene 缺失0.01未知突變0.04基因變異頻率(%)基因變異頻率(%)a 地貧8.

6、53b 地貧Normal (/) 正常+ thal trait(/-3.7)(/-4.2) 靜止型單一基因缺失或喪失功能臨床無任何癥狀，一般血液學(xué)檢查無異樣，僅平均紅細(xì)胞體積(MCV) 位于正常值下限。Normal (/) 正常+ thal traiHb H disease(- 3.7/-SEA)(- 4.2/-SEA)o Thal trait( /-SEA)( - / - )血紅蛋白H病3個基因缺失或喪失功能肝脾腫大，中度貧血。小細(xì)胞，低色素，HbH含 量較高，易發(fā)生溶血，有些病例需不定期輸血， 癥重者甚至需切除脾臟。 標(biāo)準(zhǔn)型2個基因缺失或喪失功能臨床無癥狀，血液學(xué)檢查出現(xiàn)輕微貧血，紅細(xì)胞大

7、小不均一，平均紅細(xì)胞體積(MCV) 及平均血紅蛋白含量(MCH)明顯偏低。Hb H diseaseo Thal trait血紅蛋白HHb Barts Hydrops(-SEA/-SEA) Hb Barts 水腫胎兒綜合癥 4個基因缺失或喪失功能患胎于妊娠晚期或產(chǎn)后數(shù)小時內(nèi)死亡，全身水腫，肝脾腫大。由于胎兒無法合成亞基，臍血血紅蛋白（ Hb Barts ，4）含量高。Hb Barts Hydrops Hb Barts 水腫省份例數(shù)非缺失型缺失型aaT/-、aaT /aaT-a3.7 /-a4.2 /-a2.7 /-nn%n%n%n%廣西1366044.13525.73928.721.5廣東136

8、2719.97152.23827.9-四川551934.52749.1916.4-江西27829.6829.61140.8-香港38513.22668.4718.4-臺灣22511450.79441.8177.5-合計61723337.826142.312119.620.3省份例數(shù)非缺失型缺失型aaT/-、aaT /aaT-a3.a2a1T a2- - a1a2Ta1 -a1T - -a2a1T a2- - a1a2Ta1 -a1T 重型-地中海貧血所有患者有組織缺氧癥狀，可出現(xiàn)“地中海貧血面容”，生長發(fā)育遲緩。紅細(xì)胞體積小且低色素。過剩的游離鏈形成鏈包涵體，引起溶血性貧血，靠輸血維持生命。/

9、 、0/ 0 、0/ （純合子或雙重雜合子） 輕型-地中海貧血患者癥狀較輕，輕度貧血，輕度肝脾腫大。紅細(xì)胞脆性降低，小細(xì)胞，低色素，MCV、MCH較低。A/ 、A/ 0 （雜合子） 重型-地中海貧血/ 、0/ 0 、0/ 中間型-地中海貧血患者臨床癥狀介于重型和輕型之間，如中度偏重貧血，生長發(fā)育遲緩，黃疸等。血液檢查呈小細(xì)胞低色素貧血癥。/ 、/ 0 （純合子或雙重雜合子） 中間型-地中海貧血/ 、/ 0 突變類型廣州臺灣香港廣西四川貴州湖北福建n%n%n%n%n%n%n%n%CD41-4218440.720236.34547.98344.21723.61740.51229.31441.265

10、410022.122840.72021.3126.4912.5716.71741.51338.3-286714.8447.977.43619.268.312.437.312.9CD17419.1386.899.53619.22433.41638.137.3411.8CD71-72153.330.50042.111.40012.400Cd26112.491.611.1-29102.210.211.142.179.712.437.312.9CD43920.10.2-31.611.40024.912.9突變類型廣州臺灣香港廣西四川貴州湖北福建n%n%n%n%n%排序出生缺陷例數(shù)發(fā)生頻率(/10000

11、)1先天性心臟病26019.662重型a地貧20815.733多指20015.124肢體短縮1118. 395唇裂/腭裂1098.24排序出生缺陷例數(shù)發(fā)生頻率1先天性心臟病26019.662重型可同時檢測 -SEA、-3.7、-4.2等3種缺失型-地中海貧血?？蓹z出無臨床癥狀的靜止型-地貧（/ -3.7、 /-4.2），應(yīng)用：婚前檢查、產(chǎn)前檢查及產(chǎn)前診斷。地中海貧血基因檢測系統(tǒng)課件地中海貧血基因檢測系統(tǒng)課件全血DNA快速提取試劑盒應(yīng)用全血DNA的提取培養(yǎng)細(xì)胞基因組DNA的提取注意事項抗凝劑:不能用肝素。紅細(xì)胞裂解干燥環(huán)節(jié)：乙醇干燥須完全,有機溶劑抑制PCR擴增. 全血DNA快速提取試劑盒PCR

12、反應(yīng)液Mix-A 21LDNA模板 4L ( 200-500ng)Total 25L96 15min98 45s64 1min30s 35 cycles 72 3min72 5min PCR反應(yīng)液Mix-A 21LM DNA Marker1. ( / ) 1.8kb2. ( / - 4.2) 1.8kb; 1.6kb3. ( / - 3.7) 2.0kb; 1.8kb4. (- 4.2 / -SEA ) 1.6kb; 1.3kb 5. (- 3.7 / -SEA ) 2.0kb; 1.3kb6. (/-SEA ) 1.8kb; 1.3kb M 1 2 3 4 5 6 M -珠蛋白基因型PCR產(chǎn)

13、物片段長度 - 3.72.0kb 1.8kb - 4.21.6kb-SEA1.3kb注：M DNA可對17個突變位點 (8個常見位點及9個少見位點)進(jìn)行檢測 合理的探針設(shè)計明顯減少了非特異性雜交反應(yīng)的發(fā)生。位點設(shè)計更合理，絕大部分突變位點都有相應(yīng)正常對照，結(jié)果易于判定 -地貧基因診斷；攜帶者檢出 可對17個突變位點 (8個常見位點及9個少見位點)進(jìn)行檢測 HBB gene HBB1HBB2HBB34142717241-42M/N65471-72M/654MHBB gene HBB1HBB2HBB341427172地中海貧血基因檢測系統(tǒng)課件用生物素標(biāo)記的引物擴增待測樣品DNAPCR-Mix-I

14、23LDNA模板 2LTotal 25L5015min95 10min94 1 min50 30s 35 cycles 72 30s72 5min 用生物素標(biāo)記的引物擴增待測樣品DNA取15 mL 塑料離心管，放入膜條，加入A液5-6 mL及PCR產(chǎn)物。將塑料管放入沸水中加熱10分鐘，取出擰緊蓋子， 放入42雜交箱雜交1.54小時。 變性及雜交取15 mL 塑料離心管，放入膜條，加入A液5-6 mL及P取出膜條，移至裝有預(yù)熱B液的50 mL管中， 于42輕搖洗滌15分鐘 取出膜條，移至裝有預(yù)熱B液的50 mL管中， 1）POD溶液孵育30分鐘2）洗滌 用A液室溫洗兩次，每次5分鐘。3）顯色 將膜條浸泡于顯色液中避光顯色10-15分鐘即可見斑點顯現(xiàn)。N/N654M/N41-42M/N1）POD溶液孵育30分鐘N/N654M/N41-42M/N41-42N654N28N71-72N17NEN31N27/28M41-42M654M28M71-72M17MEM31MIVS1