BcrAbl融合基因熒光定量RT-PCR診斷試劑盒說明書

1、Evaluation Warning: The document was created with Spire.Doc for .NET. PML/RAR融合基因熒光RT-PCR診斷試劑盒一、試劑盒采用熒光定量RT-PCR方法，快速、特異、靈敏、定量地檢測臨床白血病標本中PML/RAR融合基因的情況, 約有90%的急性早幼粒細胞白血病患者骨髓細胞和血細胞中會出現(xiàn)PML/RAR融合基因。因此檢測PML/RAR融合基因已成為診斷急性早幼粒細胞白血病以及治療后追蹤殘余白血病細胞的主要依據(jù)。二、試劑盒組成(20人份)RNA提取取液 （20mll /瓶瓶）1瓶Taq酶 （40l /管管）1管反應(yīng)液I （

2、165l /管管）1管定量標準品品 （550l /管管）8管反應(yīng)液III （165l /管管）1管DEPC H22O （5000l /管管）1管反應(yīng)液 （350l /管管）1管去離子水 （111000l /管）1管逆轉(zhuǎn)錄酶 （25l /管管）1管三、檢測步步驟 1標本采采集抽取外周血血5mll抗凝后后密封送送檢，或或3mll新鮮骨骨髓標本本密封送送檢。2標本處處理將5ml抗抗凝外周周血或33ml骨髓髓加入等等體積生生理鹽水水稀釋，取10ml離心管，先加入2ml淋巴細胞分離液，再取稀釋好的標本5ml沿管壁緩慢加入，4靜置5分鐘后，2,000rpm離心15分鐘，小心吸取白細胞層于1.5ml離心管中

3、，離心留沉淀，用生理鹽水洗沉淀一次，沉淀加入0.5ml RNA提取液，充分混勻。室溫靜置5分鐘，加入0.2ml氯仿，蓋上管蓋，用力振搖15秒，4靜置2-3分鐘，4 12,000rpm離心15分鐘， 離心后反應(yīng)管分三層，底層為微黃色的氯仿層，中間層及無色水相上層，水相上層的體積一般為提取液體積的60%。小心將上層水相轉(zhuǎn)移至滅菌的離心管中，加等體積異丙醇4靜置10分鐘，然后4，12,000rpm離心10分鐘，離心前通?？床灰奟NA沉淀，離心后可見膠狀沉淀。去上清，加入400l 75%的乙醇洗滌RNA沉淀，混勻，4 7,000 rpm離心5分鐘，小心吸去大部分乙醇。將沉淀在室溫空氣中干燥10分鐘。(

4、注： 75% 乙醇配制時須用試劑盒中提供的DEPC H2O）。用40l DEPC H2O溶解沉淀，吸出部分溶液，測A260-A280處的吸光值，并計算RNA含量。3逆轉(zhuǎn)錄錄反應(yīng)：取滅菌00.5ml離心心管, 按以以下要求求配備逆逆轉(zhuǎn)錄體體系反應(yīng)液I逆轉(zhuǎn)錄酶模板（RNNA）DEPC H22O總反應(yīng)體積積6.5ll1l2g（或或5l）7.5ll20l反應(yīng)條件：37水浴660分鐘鐘。4第一步步PCRR擴增：取滅菌00.2ml PCRR反應(yīng)管管, 按以以下要求求配備PPCR體體系反應(yīng)液IIITaq酶模板（cDDNA）去離子水總反應(yīng)體積積6.5ll0.5ll5l13l25l反應(yīng)條件：944分鐘預(yù)預(yù)變性,

5、 然然后按994 30秒54 30秒72 60秒, 共做20個循循環(huán)。5第二步步PCRR擴增：取滅菌0.2mll PCRR反應(yīng)管管, 按以以下要求求配備實實時定量量PCRR體系反應(yīng)液Taq酶模板（PCCR產(chǎn)物物）去離子水總反應(yīng)體積積14l1l5l30l50l注：每次實實驗取1105、100、100、100一組陽陽性標準準品瞬時時離心上上機即可可反應(yīng)條件：932分鐘預(yù)預(yù)變性, 然然后按993 45秒秒55 60秒秒, 共做做40個循循環(huán)。6結(jié)果分分析條件件的設(shè)定定與判定定反應(yīng)結(jié)束后后分析實實驗數(shù)據(jù)據(jù)，儀器器自動得得出未知知標本數(shù)數(shù)值。2g RNAA標本的的PMLL/RAAR融融合基因因cDNNA含量量，最終終計算結(jié)結(jié)果按下下列公式式換算：A (拷貝數(shù)數(shù)/gg總RNNA) = BB (拷拷貝數(shù)/l cDDNA) 樣本本RNAA的ODD2600值5/66。【適用儀器器】 A