基因工程實驗考試

1、簡述本學(xué)期從基因組DNA提取到重組質(zhì)粒鑒定的實驗流程。答：基因組DNA的提取,擴増目的基因,康膠電泳分離純化PW擴増的DM片段 法及頤丸的體外連接：重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選,重組質(zhì)粒的抽提：重組質(zhì)粒 的酶切鑒定。2如何正確使用微量移液器。答：選取合適量程的移液器；根據(jù)取液量設(shè)定量程；安裝吸液）槍頭；按至第- 檔，將槍頭垂直伸入液面下適當(dāng)位墨吸液,按至第二檔將滋彳本打人容器,棄掉槍頭,（ 將量程調(diào)至最犬，放回原處。3在瓊脂糖凝膠電泳點樣時，DNA通常和什么試劑混勻，其主要成分和作用是什么。答：loading Buffero主要成分為溟酚藍(lán)，二甲苯青和甘油。泯酚藍(lán)和二甲苯青起指示作用；甘油扣犬

2、樣品密度，從而沉降于點樣孔中，以.免浮出。4簡述制作1 %的瓊脂糖凝膠的操作步驟。2一聞制1盟瓊脂糖凝膠。取2別ml三角瓶，加AWOml TBE沖液，稱取1克瓊脂糖仙入韁沖液中，沸水浴加熱至完全 譜解，然后在5FC水浴中保溫。在灌膠模具中插人梳 將稱微冷卻的凝陵倒入灌胺檯具。避膠厚度35mm-避免 氣泡產(chǎn)生。5、瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受那些因素的影響。答：樣品DNA的大小和構(gòu)象，瓊脂糖濃度；電泳電場；溫度，緩沖液；嵌入染 料的存在與否；6在使用苯酚進(jìn)行DNA抽提時應(yīng)注意什么？充分震蕩使蛋白質(zhì)混均，但不能劇烈，防止將DNA鏈打斷;不要吸取中間的變性蛋白質(zhì)層。7在基因組DNA提取過程中常

3、用到酚/氯仿/異戊醇試劑，他們各有什么作用？（實驗報告） 酚是使蛋白質(zhì)變性被除去。氯仿主要作用是使蛋白質(zhì)變性并有助于液相和有機相的分離，抑制RNA酶活性，除去蛋白 質(zhì)污染。異戊醇能降低分子表面張力，減少了抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。同時有助于分相，使離心后上 層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。提取DNA實驗中，通?？梢赃x用哪些試劑沉淀DNA?冷的無水乙醇，冷的異丙醇，終濃度為0.10.25mol/L的NaCl簡述在DNA提取實驗中各試劑的作用（SDS、EDTA、酚/氯仿/異戊醇、無水乙醇、70% 乙醇）答：SDS破壞細(xì)胞膜，解聚核蛋白；EDTA整合金屬離子，抑制DNase活性；酚 氯

4、仿/異戊醇一 一見第7題,無水乙酹一 一沉淀DNA,兀乙酹一 一洗滌DNA沉淀。簡述PCR擴增技術(shù)的原理及各種試劑的作用（Mg離子、dNTP、引物DNA、緩沖液、 Taq DNA聚合酶）PU原理：變性溫度下，DN血艱i連變性艱螺旋解幵成單璉DN扎在退火溫度中人工合成 的特異引物根據(jù)堿基互補配對原則與單誰DNA特異結(jié)合，然后在DNA聚合酶的作用下， 在延伸溫度下不同的脫氧核昔酸按照堿基互補配對原則在引物的引導(dǎo)下合成與模 DNA互 補的新i連，實現(xiàn)DNA的擴増。（2）Mg2+： TaqDNA聚合酶的活性需要：dNIP：作為底物引物：作為延伸的出發(fā)點: DNA：模板；緩沖液：維持反應(yīng)環(huán)境的PH值；T

5、aqDNA聚合酶：催化DNA的合成。11.PCR循環(huán)次數(shù)是否越多越好，為什么？（實驗報告上）12降低退火溫度，延長變性時間對PCR結(jié)果有什么影響？前者會使非特異性產(chǎn)物增多；后者會導(dǎo)致酶的活性降低。如果檢測結(jié)果中出現(xiàn)了很多非特異性條帶，可能有哪些原因？引物特異性不強；Mg2+濃度過高；引物二聚體形成；退火溫度過低；循環(huán)次 數(shù)過多簡述DNA片段回收純化的原理。答：各DNA片段的大小不同，則經(jīng)瓊脂糖曉膠電泳后得到了分禽，收集含有DNA的蘆膠 部位通過濬解蘆膠、使DNA與硅膠柱結(jié)合、再通過洗滌雜質(zhì)、最后DNA洗脫,通過新的 EP管收集等，最終得到純化的目的。15為什么DNA體外連接反應(yīng)要設(shè)定在16度？

6、答：因為此溫度下能最犬限度的發(fā)揮連接酶的活性，同時有助于維持短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。簡述TA克隆試劑盒進(jìn)行體外連接的原理。答：經(jīng)DNAR合酶得到的PCR產(chǎn)物一一艱鏈DNA片段的末端具有一個突出 X 堿基， 而T載體每條鏈的亍端帶有一個突出堿基，則其兩端可以與PCK產(chǎn)物的兩端進(jìn)行正 確的T-A配對，再在連接酶的催化下，即可將目的片段連接到載體上，形成重組載體。簡述氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞的原理。（書）霞鑼轆脅的通透用冷的低滲CaCL （0.1M）溶液處理對數(shù)期的細(xì)菌， 辭稱爲(wèi)發(fā)霞鑼轆脅的通透簡述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法有哪些？CaCl2法，電擊法，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染法；花粉管通道法，基因槍法等。19當(dāng)質(zhì)粒加入宿主細(xì)胞進(jìn)

7、行轉(zhuǎn)化，再涂布在含有Amp的LB培養(yǎng)基平板前，為什么要在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h？答：使感受態(tài)細(xì)胞復(fù)蘇，同時讓重組質(zhì)粒在感受態(tài)細(xì)胞中適應(yīng)并富集，以便于表達(dá)產(chǎn)物，使 受體細(xì)胞具抗性能力。20什么情況下轉(zhuǎn)化平板上會出現(xiàn)衛(wèi)星菌落，為什么會出現(xiàn)？涂布后的培養(yǎng)基培養(yǎng)時間過長的原因，由于有抗性的菌（也就是轉(zhuǎn)化成功的菌），將抗生素 代謝掉之后，使得其周圍抗生素濃度下降，從而使其他雜菌有機會生長，形成衛(wèi)星菌落。21.堿裂解細(xì)胞抽提質(zhì)粒的基本原理是什么？答：當(dāng)菌體在NaOH和SDS滾液中裂解后，DNA和蛋白都發(fā)生變性。當(dāng)加入中和液后,由 于構(gòu)象上的區(qū)別，質(zhì)粒DNA能較快的復(fù)性呈滾解狀態(tài)，離心時留在上清液中，而染色

8、體 DMA不能復(fù)性，從而形成纏繞的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并與蛋白擬聚，因離心沉淀。22電泳檢測提取的質(zhì)粒時會看到3條條帶，這3條條帶分別代表了什么？瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時，堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，多數(shù)情況下 能看到三條帶，以電泳速度的快慢排序是：超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的 兩個質(zhì)粒連在了一起）。23.質(zhì)粒抽提中I、II、III的作用是什么？Solution I：保持菌體懸浮，抑制DNA酶活性，溶解菌體細(xì)胞壁。Solution II：破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性沉淀。Solution III：中和堿，使基因組DNA與SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀，質(zhì)粒DNA復(fù)性。 （溶液 I 50mM 葡萄糖/ 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl 溶液II 0.2M NaOH / SDS ；溶液III 3M 醋酸鉀）24什么是限制性內(nèi)切酶的星號活性？在“非最適的”反應(yīng)條件下，有些核酸內(nèi)切限制酶識別序列的特異性會發(fā)生“松動”，從其“正 確”識別序列以外的其它位點切割DNA分子，這種現(xiàn)象叫星號活性。25.細(xì)菌產(chǎn)生的限制性內(nèi)切酶，為什么不對自己的DNA發(fā)生切割作用？因為細(xì)菌能通過甲基化酶的甲基化作用保護(hù)自身的DNA不被相應(yīng)的限制酶切割降解。26影響限制性內(nèi)切酶的酶切因素有哪些？在使用工具酶時應(yīng)注意什么？1、DNA樣品量；2、酶的用量、純度、星活性；3、反應(yīng)緩沖