大腸桿菌的噬菌體培訓(xùn)課件

1、噬菌體簡介組成：蛋白質(zhì)、核酸.結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)外殼、尾巴尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。 是比細(xì)菌還小得多的微生物，噬菌體侵犯細(xì)菌，可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。Bacteriophage(phage) 噬菌體簡介組成：蛋白質(zhì)、核酸. 是比細(xì)菌還小得多的微生物 噬菌體或病毒的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為： 1.高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞； 2.自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增。 大腸桿菌的-噬菌體（一） -噬菌體的生物學(xué)特性1、由外殼包裝蛋白和-DNA組成2、 -DNA的物理圖譜（1）功能相近的基因在基因組中聚集在一起 目前已經(jīng)被確定的基因

2、至少61種，一半為必需基因 大腸桿菌的-噬菌體（一） -噬菌體的生物學(xué)特性1、由外48.5kb（2）線狀雙鏈DNA，兩端各有一個12bp的互補(bǔ)單鏈（粘性末端，cohesive-end site），稱cos site ，粘性末端粘連接變成環(huán)狀DNA。cos位點(diǎn)是噬菌體包裝必需序列。 48.5kb（2）線狀雙鏈DNA，兩端各有一個12bp的互補(bǔ)噬菌體基因大致分為3個區(qū)： 功能區(qū)：裂解相關(guān)S和R，復(fù)制相關(guān)O和P非必須區(qū)： 非必須，基因重組int（intagrate）及xis（excision）結(jié)構(gòu)區(qū)：A J19個基因，編碼頭、 尾部蛋白質(zhì)噬菌體基因大致分為3個區(qū)： 功能區(qū)：裂解相關(guān)大腸桿菌的噬菌體培

3、訓(xùn)課件3、感染周期（溶菌循環(huán)）DNA復(fù)制早期：一個ori ，雙向復(fù)制晚期：滾環(huán)復(fù)制-多個DNA分子形成線狀多聯(lián)體3、感染周期（溶菌循環(huán)）DNA復(fù)制早期：一個ori ，雙向 頭部包裝蛋白首先結(jié)合在cos區(qū)的附近，形成包裝啟動復(fù)合物，A蛋白切割cos位點(diǎn)。包裝E 頭部包裝蛋白首先結(jié)合在cos區(qū)的附近，形成包裝啟動復(fù)合物，4、溶源狀態(tài)的建立 噬菌體感染大腸桿菌后，DNA直接整合到宿主細(xì)胞染色體DNA上，并不裂解細(xì)胞，這種情況稱為溶源狀態(tài)。DNA重組技術(shù)一般需要噬菌體處于溶源狀態(tài)。 整合主要由cI和int基因的產(chǎn)物所激活，這兩個基因的開放與關(guān)閉取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。cI基因：編碼阻遏蛋白，是感染了

4、噬菌體的寄主細(xì)胞進(jìn)入溶源化的必要條件。cI基因失活或缺失的噬菌體無法使寄主細(xì)胞發(fā)生溶源化效應(yīng)。4、溶源狀態(tài)的建立 噬菌體感染大腸桿菌后，DNA直接整噬菌體基因組可以整合到大腸桿菌染色體DNA上，成為原噬菌體。適當(dāng)條件下，原噬菌體又可以脫離寄主染色體，重新變成獨(dú)立的復(fù)制子，這種過程叫做原噬菌體的刪除作用。超感染免疫性 噬菌體DNA的整合與刪除： 溶源性細(xì)菌，由于含有原噬菌體，故不能再次被同種噬菌體感染。溶源性細(xì)菌所具有的這種抗御同種噬菌體再感染的特性叫做超感染免疫性。噬菌體基因組可以整合到大腸桿菌染色體DNA上，成為原噬菌體。噬菌體的溶源和裂解入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原兩種生活方式

5、生存和繁殖。侵犯細(xì)菌時，只是DNA侵入，然后利用細(xì)菌的酶來復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。噬菌體的溶源和裂解入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原兩 -DNA載體的構(gòu)建噬菌體的缺陷： 基因組太大（48.5kb）； 酶切點(diǎn)太多，它有5個BamH1位點(diǎn)（GGATCC），6個Bg位點(diǎn)（AGATCT），5個EcoR位點(diǎn)（GAATTC）。 野生型只能接納一定長度的DNA。若相當(dāng)于噬菌體的75-105%，那么只能接納48.5kb5%=2.425kb的DNA。 重組的DNA分子難于直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞利用體外包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入DNA。 -DNA載體的構(gòu)建噬菌體的缺陷： 切去部分非必須的區(qū)域； 抹去多余的

6、限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)； 插入可供選擇的標(biāo)記基因； 建立體外包裝系統(tǒng)。構(gòu)建噬菌體克隆載體的基本策略：構(gòu)建噬菌體克隆載體的基本策略：插入型載體、取代型載體 根據(jù)切除的多少，將-DNA分為兩大類載體：1、縮短長度野生型:上限51kb -DNA：48.5kb，外源基因2.5kb-DNA上有40-50%的DNA是復(fù)制，裂解所不必需的，切除便提高裝載量。插入型載體、取代型載體 根據(jù)切除的多少，將-DNA分為兩大插入型載體（insertion vector）經(jīng)改造后只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn),長度為37kb，為包裝的下限，它本身也能被包裝，允許插入片段最大為14kb.必須攜帶標(biāo)記基因插入型載體（

7、insertion vector）經(jīng)改造后只具有取代型載體（substitution vector）具有成對的克隆位點(diǎn),空載的載體DNA只26kb，不能被包裝，無法進(jìn)入受體細(xì)胞中去,不需要標(biāo)記基因.取代型載體（substitution vector）具有成對插入型載體只能承受較小分子量（一般在10kb以內(nèi)）的外源DNA片段的插入，廣泛應(yīng)用于cDNA及小片段DNA的克隆。應(yīng)用：替換型載體可承受較大分子量的外源DNA片段的插入，所以適用于克隆高等真核生物的染色體DNA。插入型載體只能承受較小分子量（一般在10kb以內(nèi)）的外源DN 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn):野生型DNA鏈上有5個EcoRI位點(diǎn)和7個Hin

8、dIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個. 為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn). 2、酶切位點(diǎn)的刪除或增加 采用定點(diǎn)突變技術(shù)或甲基化酶處理必需區(qū)內(nèi)的酶識別序列使其失活。 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn):野生型DNA鏈上有2、酶切位點(diǎn)3、滅活某些與裂解周期有關(guān)的基因 將無義突變引入噬菌體裂解周期所需的基因，如將頭部包裝蛋白基因的CAG突變成UAG。這些噬菌體只能在具有特異校正基因編碼產(chǎn)物的菌株內(nèi)繁殖。 當(dāng)這種DNA進(jìn)入一般大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，可阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散。基因工程實驗中使用的受體是具有琥珀型突變體校正功

9、能的菌株。3、滅活某些與裂解周期有關(guān)的基因 將無義突變引入噬菌體裂4、加裝選擇標(biāo)記 野生型-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容。選擇標(biāo)記主要有兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記4、加裝選擇標(biāo)記 野生型-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，(1)免疫功能失活標(biāo)記 (cI篩選) 加裝選擇標(biāo)記cI基因cI基因編碼一種阻止-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶源狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成混濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活， -重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。(1)免疫功能失活標(biāo)記 (cI篩選) 加裝選擇標(biāo)記cI基因(

10、2)加裝選擇標(biāo)記lacZ（藍(lán)白斑篩選） lacZ基因編碼-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑。(2)加裝選擇標(biāo)記lacZ（藍(lán)白斑篩選） lacZ基因編碼5、建立-噬菌體的體外包裝系統(tǒng)體外包裝原理： 噬菌體的頭部和尾部的裝配是分開進(jìn)行的。頭部基因發(fā)生了突變的噬菌體只能形成尾部和頭部蛋白所需的蛋白因子； 將這兩種突變型的噬菌體的提取物混合起來，便能夠在體外裝配成有生物活性的噬菌體顆粒。尾部基因發(fā)生了突變的噬菌體則只能形成頭部和尾部蛋白所需的蛋白因子。5、建立-噬菌體的體外包裝系統(tǒng)體外包裝原理： 將這兩種大腸桿菌的噬菌體培訓(xùn)課件（三）-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)可在體外包裝成噬菌體顆粒，高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌-DNA載體的