真核細胞RNA的制備和逆轉(zhuǎn)錄PCR-毛宇彬課件

1、實驗五 真核細胞RNA的制備和Trizol 法提取組織或培養(yǎng)細胞總RNA 實驗背景知識哺乳動物中，平均每個細胞大約含有10-5ugRNA。RNA的分子組成：rRNA（占RNA總量的80%85%），由28S、18S、5.85S及5S幾類組成，它們之間同源性大、分子量變化不大，所以可根據(jù)它們的密度和分子大小，通過密度梯度離心，凝膠電泳或離子交換層析進行分離。tRNA和核內(nèi)小分子RNA（占10%15%）mRNA（占1%5%）。 mRNA分子群體編碼細胞內(nèi)所有的多肽和蛋白質(zhì)，因而是分子生物學中重要的研究對象。 mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一，細胞中含量少，3端存在20230個多聚腺苷酸poly

2、(A)。利用此特征，可很方便地從總RNA中，用寡聚（dT）親和層析柱分離mRNA。 RNA通常以單鏈形式存在，但也可形成局部的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 RNA分子的種類較多，分子大小變化較大，功能多樣化。RNA的種類、分布、功能一、實驗?zāi)康暮驮砟孓D(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）是一種檢測細胞及組織中特異性基因mRNA表達的實驗室技術(shù)。在中心法則中，可以以mRNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成cDNA。所獲得的cDNA反映了結(jié)構(gòu)基因的組成，可用于構(gòu)建cDNA文庫并進行基因的表達調(diào)控等研究。 RT-PCR擴增目的基因原理首先，以細胞或組織中分離的總RNA中的mRNA為模板，加入特異性3引物或多聚T錨定引物或隨機引物

3、，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA鏈；然后，以cDNA鏈為模板，由RNA依賴的DNA聚合酶催化合成相應(yīng)互補的cDNA拷貝，后者能進一步用于PCR擴增。擴增特異的基因片段，通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行分析，以代表該基因的mRNA水平表達情況。 分離純凈、完整的RNA對于分子克隆的實驗是很重要的，而且是進行基因表達分析的基礎(chǔ)。的成敗很大程度上決定于RNA的質(zhì)量。在所有RNA實驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染，RNA酶很穩(wěn)定，一般而言反應(yīng)不需輔助因子，RNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶類，它耐熱、耐酸、耐堿，蛋白質(zhì)變性劑可使之暫時失活。

4、RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起嚴重的后果。 RNA分離的最關(guān)鍵因素是盡量避免RNA酶的污染。實驗中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品都需特別處理。一方面避免外源RNase的污染。要做到如下幾點：操作戴口罩和手套；實驗室保持潔凈；玻璃器皿須用0.1%二乙基焦碳酸鹽（DEPC）浸泡處理，并高壓滅菌，250烘干4小時以上（高壓不能完全滅活RNase）；所有溶液（除Tris外）須經(jīng)DEPC浸泡處理；實驗中所有塑料器材最好滅菌后一次性使用，所有化學試劑用新包裝。另一方面排除內(nèi)源RNase污染。內(nèi)源RNase是由組織細胞中攜帶，細胞破碎后即釋放出來。因而力爭在提取的起始階段對RNase活力進

5、行有效抑制，主要方法是使用RNase抑制劑，常用的有鹽酸胍、異硫氰酸胍、RNase阻抑蛋白（RNasin）和氧釩核糖核苷復合物等。 所有分離提取RNA的方案的第一步操作都是在能導致RNA酶變性的化學環(huán)境中裂解細胞，然后才將RNA從各種生物大分子中分離出來。決定采用何種合適的制備方法，取決于RNA的細胞來源及其最終用途。本實驗介紹從真核細胞中提取總RNA的通用方法，細胞用異硫氰酸胍裂解，此過程操作較少，從許多來源都能獲得純凈的RNA，是從高內(nèi)源性RNA酶的組織中提取RNA的首選方法。 PCR技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展: .1971年Khorana于最早提出核酸體外擴增的設(shè)想 .1985年美國PE-Cetu

6、s公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明PCR技術(shù) .1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶,即Taq酶,該酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛應(yīng)用 .在引物指導下由酶催化的對特定的克隆或基因組DNA序列進行的擴增反應(yīng) PCR反應(yīng)成分:1 DNA模板: .純度要求不是很高,但不能含有影響擴增反應(yīng)的物質(zhì) .模板DNA的量不要太多,過猶不及 .模板DNA制備過程中應(yīng)防止樣品間的交叉污染2引物: .濃度一般為0.1-0.5M .凍干引物-20至少可以保存12-24個月,液體狀態(tài)-20 可保存6個月3Taq酶: .50l體系中酶用量0

7、.5-2.5U .激活劑與抑制劑PCR循環(huán)參數(shù)的設(shè)置:1變性: .95 變性20-30s即可使一般的DNA分子完全變性,對于富含G.C的模 板適當提高變性溫度2退火: .溫度一般為引物Tm-5 ,時間一般為20-40s,若模板含量少,可在前幾個循環(huán)中適當延長退火時間,有利于引物與模板結(jié)合,提高反應(yīng)靈敏度3延伸: .溫度由所用的聚合酶決定,一般為70-75 ,延伸時間由擴增片段的長度決定,一般Taq酶延伸速率為60個堿基/s 150bp可省延伸步驟, 500bp 需20s, 500-1200bp 需40s 4循環(huán)次數(shù): .一般為25-35次,在得到足夠產(chǎn)物的前提下應(yīng)盡量減少循環(huán)數(shù)二、實驗材料組織

8、細胞：新鮮動物肝臟塑料制品： 盡可能使用無菌、一次性塑料制品，已標明 RNase-Free 的塑料制 品，如沒有開封使用過通常沒有必要再次處理。對于國產(chǎn)塑料制品，原則上都必須處理方可使用。處理步驟如下： 1在玻璃燒杯中注入去離子水，加入 DEPC（焦碳酸二乙酯） 使 DEPC 的終濃度為 0.1%。注意：DEPC 為劇毒物，活性很強，小心在通 風柜中使用。2處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入 DEPC 水溶液， 使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 3在通風柜中室溫處理過夜。 4將 DEPC 水溶液小心倒到廢液瓶中，用鋁箔封住DEPC 水處理 過的塑料制品的燒杯，7080烘拷干燥

9、，高溫高壓蒸氣滅菌至少 30 分鐘。 5烘箱用合適的溫度（7080）烘拷至干燥。置于干凈處備用。 玻璃和金屬物品：250 烘烤3小時以上或180烘烤8小時。 其它試劑：無水乙醇、氯仿 、DEPC處理過的水、75%乙醇（用DEPC處理水 配制）、0.5%（m/V）SDS（DEPC處理）三、方法和步驟1a：對于組織來源的材料：按50100mg組織樣品加入1ml Trizol。組織體積不能超過Trizol體積的10，用勻漿器充分勻漿至透清。1b：對于培養(yǎng)的細胞：離心收集細胞后，棄上清，用移液管加Trizol反復吹打，裂解細胞至均一透亮的液態(tài)后，將勻漿樣品在室溫孵育5 分鐘以使核蛋白體完全分解。每5-

10、10106的動物細胞加1ml的Trizol。2加入0.2 ml氯仿，振蕩15秒，靜置2min。34 離心，12000rpm10min，取上清。4加入0.5 ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。54 離心，12000 rpm10min，棄上清。6加入1ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，4 離心，7500 rpm10min，取上清。7晾干，加入適量的DEPC水溶解（65 促溶1015min）。8總RNA定量及純度檢測： 取15 l RNA溶液于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，沒有降解的RNA電泳圖18s、28s rRNA條帶明顯。 取5l樣品稀釋后測OD260、OD280，計算OD26

11、0/OD280。RNA純品的比值為2.0，若比值較低，說明有殘余蛋白質(zhì)存在；比值太高，則提示RNA有降解。四、注意事項1此方法提取RNA A260/A280值在大于或等于1.8。 2組織或細胞量過少，可酌情減少Trizol用量；組織或細 胞用量過多，會引起DNA對RNA的污染；高蛋白、脂肪或多糖類組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿或液氮研磨后須 4 12,000g離心 10min去掉不溶物，再進行下面操作，若頂層有脂肪物，則也須去掉。3RNA樣品電泳檢測時，如果18S rRNA、28S rRNA條帶模糊不清，有以下兩種情況：a樣品量太多，造成分辨率下降，應(yīng)適當稀釋樣品再泳。b樣品操作時降

12、解，與器皿處理不嚴格、操作方法不嚴格、組織不新鮮有關(guān)。 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR） 二方法和步驟1. 逆轉(zhuǎn)錄（1）取一個200ul的EP管，加入1ug總RNA，加入以下反應(yīng)物： Oligo-dT12-18 引物 1 l dNTP mixture 1 l DEPC 水 X 總體積為10 l（2）65 ，5min，迅速置冰2min以上。（3）離心數(shù)秒使模板RNA與引物聚集于管底。 （4）在上述管中加入以下試劑 5反應(yīng)buffer 4 l RNase 抑制劑 0.5 l 逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5 l DEPC 水 5 l 總體積20ul（5）混勻后置于42 ，60min。（6）置于70 ，15min后冰上

13、冷卻。（7）測定cDNA產(chǎn)物的濃度： 取5ul樣品稀釋后測OD260、OD280，計算 OD260/OD280，純品cDNA比值為1.8。（3）在PCR儀上按以下反應(yīng)程序進行PCR循環(huán)反應(yīng)。 反應(yīng)程序：第一步：95C 2min 第二步：95C 30s 第三步：56C 45s 30循環(huán) 第四步：72C 45s 第五步：72C 10min 第六步：4C 2h（4）取10ul反應(yīng)液加入2 l 6loading buffer 進行1瓊脂糖凝膠電泳（5）在凝膠成像系統(tǒng)上觀察記錄實驗結(jié)果，判斷PCR擴增產(chǎn)物分子量是否與理論一直。-actin目的片段理論大小為約400bp左右。 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.250kb之間 四思考題1RNA的分離提取和RNA樣品的保存過程中如何防止RNA降解？2如何判斷提取的染色體DNA樣品的質(zhì)量？ 3、簡述mRNA逆轉(zhuǎn)錄的基本原理。4、PCR的基本原理。5、PCR反應(yīng)產(chǎn)物中出現(xiàn)非特異條帶的原因是什么？如何克服？附：各種組織細胞RNA產(chǎn)量Hela cells 1.6mg/108cellsMouse intestine 2.3mg/g組織Mouse spleen 8.3mg/g組織Mouse l