丹參鑒定學(xué)專論課件

1、10/6/2022中藥鑒定學(xué)專論丹參分子生藥研究10/6/2022一、丹參的傳統(tǒng)鑒別方法與分子生藥鑒別二、丹參分子基因組的分析及構(gòu)建三、不同產(chǎn)地丹參分子生藥基因組的分析四、高質(zhì)量的丹參葉片DNA的提取方法研究10/6/2022第一部分：丹參的傳統(tǒng)鑒別方法與分子生藥鑒別。10/6/20221丹參形態(tài)學(xué)鑒別植物學(xué)特性鑒別傳統(tǒng)方法大多根據(jù)丹參的形態(tài)方面對(duì)藥材的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別。丹參為多年生草本,根磚紅色,莖高4080 cm,多分枝,被長(zhǎng)柔毛。葉常為奇數(shù)羽狀復(fù)葉。葉柄長(zhǎng)17 cm,小葉37,頂端小葉較大。小葉卵形或橢圓狀卵形。長(zhǎng)1. 58 cm,寬0. 85cm,先端鈍,邊緣具圓鋸齒,兩面被柔毛,下面較密

2、,花序頂生或腋生輪傘花序有花6至多花,組成假總狀花序,密被腺毛及長(zhǎng)柔毛;小苞片披針形;花萼鐘狀,長(zhǎng)11. 3 cm,先端二唇形,萼筒喉部密被白色柔毛;花冠藍(lán)紫色,二唇形,長(zhǎng)22. 7 cm,花冠筒外伸,彎曲,上長(zhǎng)達(dá)2 cm,筒內(nèi)有毛環(huán);雄蕊2,藥隔長(zhǎng),花絲短,上臂藥室發(fā)育, 2下臂的藥室不育且聯(lián)合;小堅(jiān)果4,橢圓形,花期58月,果期89月。10/6/2022 丹參形態(tài)10/6/2022丹參藥材根部形態(tài)10/6/2022水試鑒別法：用水浸泡丹參根的方法對(duì)丹參進(jìn)行鑒別,正品丹參根浸泡后的溶液無(wú)色,藥材稍膨脹,顏色稍微變淺。偽品丹參溶液顯紅色藥材變?yōu)榈t色。水浸后續(xù)斷會(huì)被染成紅色,粉末中有草酸鈣簇晶

3、;丹參水浸不染成紅色,粉末中無(wú)草酸鈣簇晶,但有石細(xì)胞及紅棕色物為丹參。從而將兩者進(jìn)行區(qū)分。10/6/2022根的橫切面顯微結(jié)構(gòu)鑒別根據(jù)丹參橫切面顯微結(jié)構(gòu)特征與紫丹參進(jìn)行區(qū)分,丹參(Salvia miltiorrhizaBge. )木栓層37列,木栓細(xì)胞長(zhǎng)方形,切向延長(zhǎng),壁非木化或微木化;外側(cè)有時(shí)可見(jiàn)落皮層。皮層窄,纖維單個(gè)散在或26個(gè)成群,孔溝放射狀,層紋細(xì)密。韌皮部較窄,由篩管群和薄壁細(xì)胞組成。形成層明顯成環(huán)。木質(zhì)部寬廣, 412 mm呈放射狀排列。有些相鄰的束在內(nèi)側(cè)合并,導(dǎo)管類圓形或多角形,有的沿徑向延長(zhǎng),直徑1565 mm,單個(gè)散在或212個(gè)成群,徑向排列或切向排列;木纖維發(fā)達(dá),多成群分

4、布于大導(dǎo)管周?chē)?有的本質(zhì)部束內(nèi)有12群木化薄壁細(xì)胞;木射線寬廣,射線細(xì)胞多木質(zhì)化增厚。紫丹參根莖表皮細(xì)胞1列,內(nèi)含紫紅色物質(zhì);皮質(zhì)薄壁細(xì)胞有的具紋孔;髓部薄壁細(xì)胞壁呈連珠狀增厚或稍增厚,具紋孔。根本質(zhì)部束常較小,導(dǎo)管也少。10/6/2022根粉末的顯微結(jié)構(gòu)鑒別丹參粉末呈紅棕色。木栓細(xì)胞黃棕色,表面觀呈類方形或多角形,壁稍厚,胞腔內(nèi)常含紅棕色色素,色素溶解后,斷面觀細(xì)胞類長(zhǎng)方形,排列較整齊。木纖維多成束,長(zhǎng)梭形,紋孔斜裂縫狀或十字狀,孔溝稀。導(dǎo)管主要為網(wǎng)紋和具斜紋孔導(dǎo)管。石細(xì)胞呈類圓形、類三角形、類梭形、類長(zhǎng)方形或不規(guī)則形,也有延長(zhǎng)呈纖維狀,有的胞腔內(nèi)含棕色。10/6/2022花粉形態(tài)學(xué)特征對(duì)丹

5、參及同屬藥用植物的鑒別一定的植物具有一定形態(tài)的花粉,因此花粉形態(tài)研究也是植物分類鑒別的依據(jù)之一。丹參的花粉以外壁較薄、紋飾網(wǎng)眼較淺、網(wǎng)脊較粗、溝較寬、溝底具顆粒而區(qū)別于其他種。10/6/2022薄層色譜鑒別采用薄層色譜定性鑒別的方法比較后指出在同一展開(kāi)系統(tǒng)的條件下,無(wú)論是野生還是栽培品種,丹參的一些主要成分相同,以此可以作為識(shí)別丹參藥材真?zhèn)蔚膮⒖家罁?jù)。10/6/2022紫外吸收光譜鑒別丹參在253, 277 nm兩處有吸收特征峰,而甘西鼠尾在264,248, 218, 203 nm 4處有吸收特征峰。作丹參使用的藥材紫外吸收光譜的范圍不同,據(jù)此可以對(duì)兩者進(jìn)行鑒別。丹參粉末處理后置紫外燈(365

6、nm)下現(xiàn)察顯亮藍(lán)灰色熒光。10/6/2022分子生物學(xué)鑒別方法1RAPD鑒別法：隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于物種鑒別。2DNA遺傳標(biāo)記技術(shù)隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的日趨成熟,從遺傳DNA分子水平檢測(cè)生物遺傳多樣性并進(jìn)行分類與鑒定已成為可能。DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)具有快速、微量、特異性強(qiáng)的特點(diǎn),且不受生長(zhǎng)發(fā)育階段、供試部位、環(huán)境條件的影響,已在中藥鑒定學(xué)研究中展示了良好的應(yīng)用前景,并保持強(qiáng)勁的發(fā)展勢(shì)。10/6/2022第二部分 丹參分子基因組的分析及構(gòu)建10/6/20221丹參主要居群DNA指紋圖譜的建立2丹參EST序列中SSR信息的分析及建立10/6/2022丹

7、參主要居群DNA指紋圖譜的建立基因組DNA的提取編號(hào) 名稱 來(lái)源 花顏色Al 大葉丹參 四川中江 紫色A2 商洛丹參 陜西商洛 紫色A3 首縣紫花丹參 山東芭縣 紫色A4 四倍體丹參 中國(guó)藥科大學(xué) 紫色A5 芭縣白花丹參 山東芭縣 紫色A6 北京丹參 中國(guó)中醫(yī)藥研究院 紫色A7 毫州丹參 安徽亳州 紫色A8 丙城丹參 山西茵城 紫色A9 江蘇丹參 江蘇射陽(yáng) 紫色A10 小葉丹參 四川中江 紫色A11 安國(guó)丹參 河北安國(guó) 紫色A12 甘西鼠尾草 甘肅 紫色A13 一串紅 陜西省雜交油菜研究中心 紅色A14 油菜 陜西省雜交油菜研究中心 黃色A15 小麥 陜西省雜交油菜研究中心 注:Al一Al，為

8、各居群編號(hào)，以下同。10/6/2022RAPD一PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序的優(yōu)化別設(shè)計(jì)M擴(kuò)+、Taq酶、模板DNA的濃度及退火溫度等單因子試驗(yàn)，同時(shí)保持?jǐn)U增體系的其它成分濃度及擴(kuò)增程序其它環(huán)節(jié)不變，以優(yōu)化、確證適宜的M擴(kuò)+、Taq酶、模板DNA的濃度及退火溫度。10/6/2022鑒別丹參與其近緣和遠(yuǎn)緣植物的特征引物及其DNA指紋圖譜引物s2035、s222擴(kuò)增結(jié)果不僅穩(wěn)定、條帶明亮，而且采用引物s2035、s232建立的指紋圖譜丹參主產(chǎn)區(qū)的n個(gè)居群丹參的PCR擴(kuò)增帶型幾乎相同(1一n泳道)，其中有200一1100bp的七條共同的特異條帶，即圖6的條帶Cl、CZ、C3、C4、圖7的CS、C6、

9、C7，各丹參居群完全相同。10/6/2022丹參EST序列中SSR信息的分析及建立丹參EST序列中SSR信息的分析 微衛(wèi)星（Microsatellite）又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simplesequence repeat)，指的是基因組中由 16 個(gè)核苷酸組成的基本單位重復(fù)多次構(gòu)成的一段 DNA，廣泛分布于基因組的不同位置，長(zhǎng)度一般在 200bp 以下SsR 分子標(biāo)記具有數(shù)量豐富，多性高，多等位基因，共顯性，重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)建立 SSR 標(biāo)記的序列性質(zhì)不同可分為基因組 SSR （Genomic SSR,gSSR） 和表達(dá)序列標(biāo)簽 SSR（Expressed sequence tag SSR，ES

10、T-SSR）。EST 及表達(dá)序列標(biāo)簽是通過(guò)從 cDNA 文庫(kù)中隨機(jī)挑選的克隆進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序所獲得的 5或 3端序列，長(zhǎng)度一般在 150500bp。10/6/2022丹參 EST-SSR 引物情況表 引物編號(hào) 重復(fù)基元 GeneBank EST 編號(hào) 預(yù)期產(chǎn)物bp 引物序列 退火溫度（）SSR001 (TACA)5 CV172410 241 GAGGCTACTTCGTGGAGG 52.3 GAAACTAAAGCAACAAACCC 52.1SSR002 (CA)16 CV172134 176 CCGTGGTGTTCCCTCTTT 55 TGCCGATTCTAACCTGTATG 53.7SSR003

11、 (CT)10 CV171877 137 AGAGGCTGCTGCTTCATT 52.7 TCAAGTCATAGGCGTGGC 54.5SSR004 (AAC)6 CV171649 222 AGGCAGACAGACCTCATA 46.7 CTTCCCACCAAATAACTC 46.8SSR005 (GTG)6 CV171565 153 CTCAGCACCTACTACCACAT 49.6 CTTATCCCAACACTTCTTCT 48.5SSR006 (ATC)5 CV171563 155 AAACAGAGCGACGAAGCAG 56.210/6/2022丹參的 EST-SSR 分布頻率與特點(diǎn)丹

12、參 EST-SSR 中共包含 77 種重復(fù)基元。單核苷酸重復(fù)有 1 種 A/T。二核苷酸重復(fù)也為 3 種，以 AG/CT為主，占 64.21%。三核苷酸重復(fù)為 10 種 丹參 EST-SSR 信息情況表 重復(fù)類型 基元種數(shù) SSR 數(shù) 占全部SSR 比例 出現(xiàn)頻率單核苷酸重復(fù) 1 1069 53.08 10.45二核苷酸重復(fù) 3 380 18.87 3.72三核苷酸重復(fù) 10 450 22.34 4.40四核苷酸重復(fù) 6 15 0.74 0.15五核苷酸重復(fù) 9 13 0.65 0.13六核苷酸重復(fù) 48 87 4.32 0.85總計(jì) 77 2014 100.00 19.6910/6/2022

13、 丹參二、三核苷酸重復(fù)基元情況表重復(fù)類型 基元 數(shù)量 占該類型比例 出現(xiàn)頻率單核苷酸重復(fù) A/T 1069 100.00 10.45二核苷酸重復(fù) AC/GT 60 15.79 0.59 AG/CT 244 64.21 2.39 AT/AT 76 20.00 0.74三核苷酸重復(fù) AAC/GTT 8 1.78 0.08 AAG/CTT 79 17.56 0.77 AAT/ATT 9 2.00 0.02 ACC/GGT 14 3.11 0.03 ACG/CTG 123 27.33 1.20 ACT/ATG 41 9.11 0.40 AGC/CGT 36 8.00 0.35 AGG/CCT 25 5

14、.56 0.24 AGT/ATC 95 21.11 0.93 CCG/CGG 20 4.44 0.2010/6/2022 第三部分 不同產(chǎn)地丹參分子生藥基因組的分析10/6/2022不同產(chǎn)地丹參遺傳關(guān)系的DNA標(biāo)記分析利用RAPD與ISSR標(biāo)記對(duì)不同產(chǎn)地的野生與栽培丹參的遺傳變異進(jìn)行分析,以期為丹參藥材的引種栽培與科學(xué)選育提供科學(xué)依據(jù)。不同產(chǎn)地丹參野生與栽培藥材RAPD與ISSR標(biāo)記的遺傳變異 藥材 取樣個(gè)體 多態(tài)條帶數(shù) 多態(tài)條帶比率 基因多樣性 原產(chǎn)地 P (% ) 指數(shù)(Ht) 栽培藥材S-AHBZ 8 22 21. 57 0. 075 安徽亳州 S-SXYC 8 21 20. 59 0.

15、 0708 山西運(yùn)城 S-JSBH 5 9 8. 82 0. 0361 江蘇濱海 S-SCZJ 5 13 12. 75 0. 0518 四川中江 S-JSSY 8 4 3. 92 0. 0129 江蘇射陽(yáng) S-JSRG 6 15 14. 71 0. 0474 江蘇如杲 物種水平 40 87 85. 29 0. 1934 野生藥材 S-SDYS 3 7 6. 86 0. 0314 山東沂水 S-SD 3 11 3. 57 0. 0078 山東 S-SDPY 2 12 11. 76 0. 0439 山東平邑 S-SX 2 17 16. 67 0. 0675 陜西 物種水平 10 62 60. 78

16、 0. 1738 總計(jì) 50 97 95. 10 0. 238910/6/2022結(jié)論：不同產(chǎn)地丹參的遺傳分化根據(jù)POPGENE計(jì)算不同產(chǎn)地丹參間Nei無(wú)偏遺傳距離與遺傳一致性見(jiàn)表3。10個(gè)產(chǎn)地的丹參間,產(chǎn)自山西運(yùn)城的丹參(S-SXYC)與來(lái)自江蘇濱海的丹參(S-JSBH)的遺傳距離最小,為0. 099 6;而來(lái)自山西運(yùn)城的丹參(S-SXYC)與來(lái)自山東的丹參(S-SD)的遺傳距離最大,為0. 377 7;遺傳一致性正好與遺傳距離相反,遺傳距離最小的兩個(gè)產(chǎn)地的丹參,遺傳一致性表現(xiàn)的最大, S-SXYC與S-JSBH之間的遺傳一致性最大,為0. 905 2,表明它們之間的親緣關(guān)系最近。江蘇3個(gè)產(chǎn)

17、地居群的遺傳一致性介于0. 826 7與0. 838 9之間,平均0. 833 9;山東3個(gè)產(chǎn)地的丹參遺傳一致性介于0. 689 8與0. 808 8之間,平均0. 759 7,表明不同產(chǎn)地的丹參間存在明顯的遺傳分化。10/6/2022 第四部分 高質(zhì)量的丹參葉片DNA的提取方法研究10/6/2022材料和方法樣品的采集及預(yù)處2004年7月9月份在泰山采集白花丹參的成熟葉片,涼干保存1個(gè)月。試劑和儀器1試劑CTAB(上海生工),Vc(北京鼎國(guó)),SDS (上海生工), PVP (上海生工),-mercap-toethanol(上海生工),Taq酶(Takara),AFLP corereagen

18、t kit(invitrogen,Cat No 1084-016)。2儀器PTC-100基因擴(kuò)增儀(MJ公司),Al-legra TM 64R centrifuge(BECKMAN)離心機(jī),DNA離心真空干燥器(Savant),EC-600-90 (E-C appara-tus corporation)高壓電泳儀10/6/2022方法改良CTAB法:用常規(guī)CTAB法作為基本方法,添加一些抗氧化劑和提高CTAB的比例。處理A:提取液中加Vc干粉末30 mg (15mg/mg葉片)。處理B(PVP預(yù)洗法):加PVP粉末(干葉量的10%),與干葉共同在液氮下研碎。加入4預(yù)冷的CTAB-free bu

19、ffer(02 M Tris-cl pH80, 005 MEDTA,025 M NaCl,內(nèi)含4%-mercaptoethanol),冰上放置10 min,7000 rpm(不能太高,否則膜破,DNA損失),4,離心10 min,棄上清。然后加Vc干粉末(1 mg/mg干葉片)于4CTAB提取液中,調(diào)pH值為6065DNA瓊脂糖電泳及濃度和純度的測(cè)定用08%瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280的方法判定DNA的質(zhì)量。AFLP進(jìn)一步分析DNA質(zhì)量取250 ngDNA用EcoRI/Mse I消化,限制酶切片段經(jīng)T4DNA連接酶與接頭連接及PCR擴(kuò)增,變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染顯色,以構(gòu)建出重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的基因組DNA AFLP指紋圖譜來(lái)進(jìn)一步評(píng)價(jià)DNA質(zhì)量。具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。引物組合為(E-AAG: GAC TGC GTA CCAATT CAA G; M-CCC:GAT GAG TCC TGA GTAACC C)。10/6/2022結(jié)果泰山白花丹參干葉片DNA質(zhì)量分別采用常規(guī)CTAB法、高鹽低PH法和改良的CTAB法提取白花丹參成熟干葉片DNA,結(jié)果表明,常規(guī)CTAB法、高鹽低pH法,改良CTAB中的處理A得到的總DNA都呈淺黃色至淺棕色,其余處理顏色較好(表1);高鹽低pH法,改良C