逆轉錄產(chǎn)品線-小組qa補充rt faq終極版

1、、RNAkeeper與RNAkeeper并按組織培養(yǎng)細胞一樣處理后，白細胞便能有效地保存在RNA keeper 中。、RNAkeeper可以保存細菌嗎可以。RNAKeeperRNAKeeper中不能生長，且能保持其完整性。大腸桿菌保存在RNA keeper 中，可 4保存 1 個月。RNA、RNAisolater可以提取miRNA、RNA提取時RNase8離心管必須使用無 RNase 產(chǎn)品或用 DEPC 處理。移液器最好是專用的，用前用 、去離子水/緩沖液一定要用DEPC處理并確保無RNase75%RNaseRNA 降解的（如胰腺組織）或堅硬的組織（如骨骼）、質(zhì)粒抽提質(zhì)粒抽提往往用到RNase

2、RNA、RNA 保存即使低溫保存，痕量的 RNase 亦會導致 RNA RNA 的最好辦法是鹽/i)(Ca2Mg2+)在含這些離子時，80加熱5分鐘會導致RNA被剪切，故如果RNA 需要被加熱，保存液需要含適當濃度的螯合劑。、RNA提取RNA的完整性對于后續(xù)的qPCR或PCRRNARNA 28S 18SmRNA smear 28S 18S 條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且 28S 的亮度在 18S 條帶的一倍以上，我們就可以認為RNA完整性較好，可以用于做進一步的反轉錄及、RNA、組織起始量太少或者太多：樣品量過少，則細胞組織中RNA 含量較低；樣RNA得率低、RNA 發(fā)生降

3、解：如果使用者確定提取 RNA 的試劑/器具沒有問題，RNA 的降解通常發(fā)生在樣品破碎/RNase活性：RNase較低的并且較容易勻漿的組織；2.RNase含量高或不易勻漿的組織，如、RNA、原始組織樣本或細胞量太少：提高加入量、RNA發(fā)生降解：如果確定提取RNA的試劑/器具沒有問題，RNA的降解通、加入異丙醇后室溫沉淀 10min 或-20冰箱沉淀 30min 即可，無需過夜沉淀、根據(jù)RNA20-40lDEPCRNA有基因組DNA提到上層的水相中，中、下層是有機相，含有氯仿。DNA 即存在于中層。氯仿DNA的污染。吸取上層液體時，應非常小心，避免吸到中間層和下層，為RNA、纖維組織：心臟/骨

4、骼肌等纖維組織抽提RNA 關鍵在徹底破碎組織。這些組RNA磨組織，再快速勻漿，能有效滅活核酶。但如果裂解液太粘稠(因為核酸含量高的緣故)抽提不能有效分層；加入更多裂解液可以解決此問題。多次抽提可以DNADNA解后再次抽提，可以去除 DNA 污染。、RNA建議分裝后在-80長期保存。在-20C、逆轉錄時，10lRNA但是不建議超過 1gRNA 的加入量在 1pg-500ng RNARNA、RNA不會抑制，只是逆轉錄產(chǎn)物cDNA、逆轉錄得到的cDNARandom primer因，所以如果后期是擴增基因，則不能加入Random primer。NoRTControl發(fā)現(xiàn)有gDNA如果在使用了gDNA

5、wiper后還存在gDNANo RT Control組的 Ct 值來判斷實驗數(shù)據(jù)是否可用。當加了模板的陽性實驗組 Ct 值比 No RT ControlCt值 5gDNA25倍，由gDNA1/325%，則可以把gDNA污染忽略；若實驗組與對照組 Ct 值相差 3 或者幾乎一致，則擴增產(chǎn)物的模板來源很大一部分是 gDNA 污染，這樣的實驗組失去定量意義。、RT-PCR、RT-PCR 是多步反應，應首先檢查反應體系。在確認PCR 以及逆轉錄反應體系沒有問題的情況下，RNA 降解是導致實驗失敗的最主要的原因。可以取少量新鮮提取或凍存的RNA 跑 1%瓊脂糖凝膠電泳，檢驗完整性。以哺乳動物細胞/組織為

6、例，完整的總RNA 在膠上能看見清晰的三條帶，分子量從大到小分別為 帶或沒有條帶，則RNA 已完全降解，需要重新提取。、RNA的純度影響后續(xù)反應：RNAisolater基于異硫氰酸胍法，主要雜質(zhì)來自于異硫氰酸胍等鹽的殘留，對后續(xù)酶反應有很大的影響。因此需要用 75%乙醇（DEPC水配制）仔細洗滌沉淀（輕彈管底讓沉淀懸浮，并靜置數(shù)分鐘）、使用T7HighYieldRNATranscriptionKit得到的RNA 如果變性膠上顯示RNA條帶小于預期大小，則很有可能是由于轉錄提前終止。轉錄提前終止分兩種情況：1.T7RNA聚合酶的終止序列會導致轉錄的提前終止，這種情況可以通過降低反應溫度到 30以增加全長產(chǎn)物的比例，但同時也會降低總體產(chǎn)量。2.GC或者存在高級結構的模板提高反應溫度到 42或者使用單鏈結合蛋白可能會有助于增加全長產(chǎn)物的產(chǎn)出。、T7 High Yield RNA Transcription Kit試劑盒的轉錄反應直接產(chǎn)物是單RNARNAiT7