腫瘤基因治療的基本策略和常用方法培訓(xùn)課件

1、腫瘤基因治療的基本策略和常用方法腫瘤基因治療的基本策略和常用方法一.腫瘤和基因治療的基本概念1.腫瘤（Tumor） 機(jī)體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個(gè)細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的異常病變。學(xué)界一般將腫瘤分為良性和惡性兩大類。 2腫瘤基因治療的基本策略和常用方法一.腫瘤和基因治療的基本概念1.腫瘤（Tumor） 2腫瘤基3腫瘤基因治療的基本策略和常用方法3腫瘤基因治療的基本策略和常用方法2.基因治療 指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的。也就是將外源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入病人的適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使

2、外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病。從廣義說，基因治療還可包括從DNA水平采取的治療某些疾病的措施和新技術(shù)。 4腫瘤基因治療的基本策略和常用方法2.基因治療4腫瘤基因治療的基本策略和常用方法5腫瘤基因治療的基本策略和常用方法5腫瘤基因治療的基本策略和常用方法3.什么是腫瘤基因治療 基因治療的經(jīng)典概念指通過外源基因?qū)巳梭w以糾正內(nèi)在的基因缺陷的療法。腫瘤基因治療不再局限于“糾正基因缺陷”，系指將外源的正?；?qū)巳梭w，達(dá)到直接或間接抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞的目的?；蚴巧?，是生物得以保持其連續(xù)性和穩(wěn)定性的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著對(duì)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制研究的不斷深人，出于對(duì)腫瘤是一種基因病的認(rèn)識(shí)，加之惡性

3、腫瘤的發(fā)病率和病死率較高，這使得惡性腫瘤的基因治療成為近年來基因治療研究的主要內(nèi)容和熱點(diǎn)。 6腫瘤基因治療的基本策略和常用方法3.什么是腫瘤基因治療6腫瘤基因治療的基本策略和常用方法4.與基因治療有關(guān)幾個(gè)概念 a.基因毒癌發(fā)生發(fā)展的第一步是活化致癌物，改變細(xì)胞內(nèi)的DNA，導(dǎo)致原癌基因的移位及擴(kuò)增，這些特殊基因的翻譯，使帶有這些異?；蚣?xì)胞的某些特性得以專一表達(dá)，一個(gè)特殊的化學(xué)物對(duì)一系列細(xì)胞有誘變及DNA修復(fù)作用者，稱為基因毒。目前人類已知的致癌物均為基因毒。 b.原癌基因(前癌基因)細(xì)胞癌基因存在于細(xì)胞基因組內(nèi)，激活前的細(xì)胞癌基因稱為原癌基因(前癌基因)，一旦原癌基因激活成癌基因便會(huì)引起細(xì)胞癌

4、變，癌基因激活后，通過其表達(dá)產(chǎn)物改變細(xì)胞生長(zhǎng)和分化規(guī)律，誘發(fā)細(xì)胞癌變。細(xì)胞癌基因被激活的途徑很多，如啟動(dòng)子插人，基因重排和擴(kuò)增，基因點(diǎn)突變和DNA分子中去甲基化等。 7腫瘤基因治療的基本策略和常用方法4.與基因治療有關(guān)幾個(gè)概念7腫瘤基因治療的基本策略和常用方法 c.抑癌基因正常細(xì)胞中存在抑制腫瘤發(fā)生的基因，稱為抑癌基因。抑癌基因的存在從最初的一個(gè)發(fā)現(xiàn)中得到證實(shí)，即一個(gè)腫瘤細(xì)胞和一個(gè)正常細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞，往往不具有細(xì)胞表型，即使兩種不同的腫瘤細(xì)胞雜交，也可能是非腫瘤性的，只有正常的親代失去某些基因之后，其子代才會(huì)發(fā)生腫瘤。后來，通過限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)分析及分子克隆技術(shù)的研究證實(shí)，正常細(xì)

5、胞中有一類對(duì)細(xì)胞增殖起負(fù)性調(diào)節(jié)作用的基因，如大腸癌中的p53基因，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和骨肉瘤中的Rb基因。這兩種基因也是目前被確認(rèn)并研究最為深人的抑癌基因。如將正常的Rb基因轉(zhuǎn)人骨肉瘤細(xì)胞，Rb基因表達(dá)增高，細(xì)胞分裂幾乎完全抑制，將Rb基因轉(zhuǎn)人前列腺細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)無影響，但抑制了細(xì)胞的癌變，所 以當(dāng)這一類的抑癌基因發(fā)生丟失，失活或變異時(shí)，就會(huì)促進(jìn)細(xì)胞惡變。 8腫瘤基因治療的基本策略和常用方法 c.抑癌基因正常細(xì)胞中存在抑制腫瘤發(fā)生二.采用基因治療腫瘤的基本策略目前國(guó)內(nèi)外惡性腫瘤基因治療基本策略包括： 1.免疫性基因治療 2.病因性基因治療 3.溶瘤腺病毒基因治療 4.自殺基因治療等9腫瘤基

6、因治療的基本策略和常用方法二.采用基因治療腫瘤的基本策略目前國(guó)內(nèi)外惡性腫瘤基因治療基1.免疫性基因治療a. 免疫性基因治療的對(duì)象 : 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，免疫系統(tǒng)發(fā)育未完善（3-4歲）和免疫機(jī)能衰退（老年人的細(xì)胞免疫和體液免疫功能均衰退）而出現(xiàn)兩個(gè)腫瘤發(fā)生的年齡高峰期。 胸腺發(fā)育不良（Digeoges）綜合癥或咽囊綜合癥是因胸腺發(fā)育不良而導(dǎo)致細(xì)胞免疫系統(tǒng)停留在未分化階段，這類患兒兼有細(xì)胞免疫缺陷和體液免疫缺陷的共濟(jì)失調(diào)，惡性腫瘤的發(fā)生率高達(dá)10%。 由此說明細(xì)胞免疫和體液免疫功能的正常或活性增強(qiáng)在抗惡性腫瘤的發(fā)生中是不可缺少的。10腫瘤基因治療的基本策略和常用方法1.免疫性基因治療a. 免疫

7、性基因治療的對(duì)象 :10腫瘤基 選擇性IgA缺乏：患者血漿中IgA極低，而IgG、IgM與細(xì)胞免疫正常，組織中缺乏分泌IgA的漿細(xì)胞，約10%發(fā)生胃癌。當(dāng)IgM缺乏時(shí)，約有8%患者發(fā)生惡性腫瘤以及淋巴網(wǎng)狀惡性疾病。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)患者免疫球蛋白很低，抗體產(chǎn)生受到嚴(yán)重影響時(shí)，臨床上病人除了反復(fù)發(fā)生化膿性感染外，其患者發(fā)生惡性腫瘤率為8-10%，常見類型為淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)腫瘤（56%）和胃腸道上皮癌（26%）。Wiskott-Aldrich綜合癥：（嚴(yán)重混合型免疫缺陷綜合癥）以血小板減少出血，反復(fù)感染為臨床特征，早期細(xì)胞免疫完善，隨之淋巴細(xì)胞減少，體外淋轉(zhuǎn)反應(yīng)缺乏，病兒很少活過青春期，約8-10%發(fā)生淋巴網(wǎng)

8、狀系統(tǒng)腫瘤。 11腫瘤基因治療的基本策略和常用方法 選擇性IgA缺乏：患者血漿中IgA極12腫瘤基因治療的基本策略和常用方法12腫瘤基因治療的基本策略和常用方法1.2 免疫性基因治療的方法 研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中存在著機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受狀態(tài)，而這種狀態(tài)可能源于腫瘤細(xì)胞本身的免疫性不強(qiáng)（如MHC表達(dá)不足），也可源于抗原遞全細(xì)胞（APC）不能提供足夠的共刺激信號(hào)（如B7）或者機(jī)體免疫因子分泌不足，在免疫性基因治療中通過以下三種方法糾正機(jī)體免疫的耐受狀態(tài)。 13腫瘤基因治療的基本策略和常用方法1.2 免疫性基因治療的方法 13腫瘤基因治療的基本策略和 a. 將某些細(xì)胞因子（如IL

9、-2、TNF-a等）的基因轉(zhuǎn)染到機(jī)體免疫細(xì)胞（如TIL、LAK細(xì)胞及細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞）中，大幅度提高機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和反應(yīng)能力。 使用細(xì)胞因子的基因治療在一定程度上克服了細(xì)胞因子注射療法需反復(fù)多次應(yīng)用，副作用嚴(yán)重等缺點(diǎn)，療效有較大幅度提高?？梢赃@樣認(rèn)為：腫瘤免疫細(xì)胞因子基因治療的開展，為惡性腫瘤患者帶來生的希望，其療效的穩(wěn)定，治療的簡(jiǎn)單、安全，已成為腫瘤免疫基因治療研究的最常用方法而獨(dú)樹一幟，前景是令業(yè)內(nèi)人士振奮的。14腫瘤基因治療的基本策略和常用方法 a. 將某些細(xì)胞因子（如IL-2、TNF-a等 b. 腫瘤細(xì)胞存在功能性MHCI類抗原和共刺激信號(hào)表達(dá)不足，將一些與免疫識(shí)別有關(guān)的基

10、因（如HLA、B7等）轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)照射后再植入腫瘤患者體內(nèi);或者表達(dá)HLA-B7的病毒載體或質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)復(fù)合物直接注射到瘤體內(nèi)，以大幅度增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫原性，誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)而提高宿主的免疫監(jiān)視功能和對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊能力，達(dá)到治愈率的提高具有積極作用。15腫瘤基因治療的基本策略和常用方法 b. 腫瘤細(xì)胞存在功能性MHCI類抗原和共刺腫瘤基因治療的基本策略和常用方法培訓(xùn)課件2 惡性腫瘤的病因性基因治療 腫瘤病因性基因治療主要針對(duì)癌基因和抑癌基因，其治療策略是抑制、阻斷癌基因的表達(dá)或替代，恢復(fù)抑癌基因的功能。從而達(dá)到治療腫瘤的目的。 17腫瘤基因治療的基本策略

11、和常用方法2 惡性腫瘤的病因性基因治療 腫瘤病因性a. 針對(duì)癌基因治療采用反義寡核苷酸、核酸、三鏈結(jié)構(gòu)寡核苷酸（Triplex-forming oligonucleotides，TFO）抑制腫瘤細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄，抑制癌基因的表達(dá)將有可能使腫瘤的基因表達(dá)調(diào)控回復(fù)到正常并使細(xì)胞重新分化或者誘發(fā)其凋亡（Apoptosis）。由于轉(zhuǎn)條是遺傳信息放大的過程，因此對(duì)癌基因的表達(dá)抑制來說更為有效，其治療前景是極為樂觀的。 18腫瘤基因治療的基本策略和常用方法a. 針對(duì)癌基因治療采用反義寡核苷酸、核b. 針對(duì)抑癌基因治療替代或恢復(fù)由于缺失或突變而丟失的抑癌基因（Tumor suppressor gene）的正常

12、功能是腫瘤病因性治療的手段而被世人所公認(rèn)。利用抑癌基因治療腫瘤，在體外的實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)治療學(xué)中取得較好的療效；但在體內(nèi)由于腫瘤體積較大；內(nèi)環(huán)境又十分復(fù)雜，基因轉(zhuǎn)移率限制等因素的干擾，抑癌基因治療的確切療效不盡人意值得進(jìn)一步研究。 19腫瘤基因治療的基本策略和常用方法b. 針對(duì)抑癌基因治療替代或恢復(fù)由于缺失3 溶瘤腺病毒基因治療 a. 溶瘤腺病毒的特點(diǎn)：具有復(fù)制性，因此所需病毒顆粒較小；能擴(kuò)展至鄰邁腫瘤細(xì)胞，作用范圍廣泛；溶瘤腺病毒可產(chǎn)生溶瘤和抗腫瘤免疫反應(yīng)；溶瘤腺病毒由于能夠復(fù)制故存在著不安全因素（轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散、活化）對(duì)腫瘤患者造成損害而失去可控性應(yīng)引起注意和警惕。 20腫瘤基因治療的基本策略和常用

13、方法3 溶瘤腺病毒基因治療 a. 溶瘤腺病毒的特點(diǎn)：具有復(fù)制b. 溶瘤腺病毒的主要分類：利用腫瘤特異表達(dá)的調(diào)控序例的表達(dá)：黑色素瘤表達(dá)酪氨酸酶，肝細(xì)胞癌表達(dá)甲胎蛋白（AFP），結(jié)直腸癌表達(dá)癌胚抗原（CEF）從而控制病毒復(fù)制。利用腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，如腺病毒復(fù)制時(shí)抵抗宿主細(xì)胞凋亡可能相關(guān)的EIB55K蛋白發(fā)生變異或缺失時(shí)，病毒復(fù)制的宿主細(xì)胞就會(huì)發(fā)生凋亡，從而使復(fù)制不能完成。代表為E1B55K剔除的d11520（onyx-015）腺病毒，它能夠在抑癌基因P53缺陷的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，從而達(dá)到裂鮮腫瘤細(xì)胞，同時(shí)又不損傷正常細(xì)胞的目的其特異的選擇性十分明顯。值得期待的是D11520和TH101病毒已進(jìn)入

14、III期臨床試驗(yàn)。這時(shí)于癌癥的預(yù)防的作用將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。 21腫瘤基因治療的基本策略和常用方法b. 溶瘤腺病毒的主要分類：利用腫瘤特異表達(dá)的調(diào)控序例的4 自殺基因治療 一些來自病毒或細(xì)菌的基因具有一些特殊的功能，其表達(dá)產(chǎn)物可將原先對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無毒的或毒性極低的前藥（Prodrug）轉(zhuǎn)換成毒性產(chǎn)物，導(dǎo)致這些細(xì)胞的凋亡。這類基因即稱為“自殺基因”（Suicide gene）由于自殺基因表達(dá)的產(chǎn)物多是能夠?qū)⑶八幋x為毒性產(chǎn)物的酶，故又稱為“前藥轉(zhuǎn)換酶基因”或“藥物敏感基因”。根據(jù)細(xì)胞自殺機(jī)制，將自殺基因作為治療性目的基因應(yīng)用于腫瘤治療的研究稱為腫瘤的自殺基因方式。在臨床實(shí)踐中設(shè)計(jì)腫瘤細(xì)胞特異性自

15、殺機(jī)制的基因治療方案對(duì)腫瘤治療具有重大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 22腫瘤基因治療的基本策略和常用方法4 自殺基因治療 一些來自病毒或細(xì)菌的基因具有一些特殊的功能a. 自殺基因療法中酶和前藥 23腫瘤基因治療的基本策略和常用方法a. 自殺基因療法中酶和前藥 23腫瘤基因治療的基本策略b. 自殺基因的特異性控制 要高效及特異性表達(dá)腫瘤自殺基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的作用，自殺基因必須局現(xiàn)于腫瘤細(xì)胞以選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞。一是利用免疫脂質(zhì)體，受體介導(dǎo)法進(jìn)行定向基因轉(zhuǎn)移或直接瘤內(nèi)注射。二是利用腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)HSV-TK基因（I型單純皰疹病毒胸腺激酶）選擇性治療腦腫瘤。三是利用腫瘤特異表達(dá)的調(diào)控序例，

16、如酪氨酸酶、甲胳蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA），在自殺基因的上游安插特異的轉(zhuǎn)條調(diào)節(jié)序例，可以實(shí)現(xiàn)自殺基因的特異表達(dá)，從而克服傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物作選擇性問題和較為嚴(yán)重的細(xì)胞毒問題，使腫瘤治療有較大幅度的進(jìn)展。 24腫瘤基因治療的基本策略和常用方法b. 自殺基因的特異性控制24腫瘤基因治療的基本策略和常c.旁觀者效應(yīng)（Bystander effect） 用外源性自殺基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后，未能轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞可因鄰近的少數(shù)腫瘤細(xì)胞攜帶有自殺基因而被前體藥物殺傷。研究發(fā)現(xiàn)，旁觀者效應(yīng)產(chǎn)生與自殺基因的種類、腫瘤細(xì)胞的類型及數(shù)量有關(guān)。TK/GCV系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng)是比較明顯和突出的。25腫瘤基因治療的基本策略

17、和常用方法c.旁觀者效應(yīng)（Bystander effect） 25腫瘤三.常采用的基因治療方法a.基因修飾腫瘤細(xì)胞“疫苗”療法 將某些細(xì)胞因子基因如IL-2、IL-4、TNF-、INF-、GM-CSF等轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，可使腫瘤細(xì)胞表達(dá)活性細(xì)胞因子。轉(zhuǎn)染細(xì)胞因子基因的腫瘤細(xì)胞基體內(nèi)致瘤性喪失，耐動(dòng)物預(yù)接腫這種轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞后，該動(dòng)物對(duì)再接種的同種腫瘤有抵抗作用。能分泌細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞具有腫瘤疫苗作用，成為新型的腫瘤“疫苗”。這種腫瘤疫苗的作用機(jī)制是由于細(xì)胞因子表達(dá)后，一方面促進(jìn)腫瘤表達(dá)特異抗原并誘發(fā)宿 主抗腫瘤細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng);另一方面分泌的細(xì)胞因子增強(qiáng)CTL和其他抗癌效應(yīng)細(xì)

18、胞的作用。 26腫瘤基因治療的基本策略和常用方法三.常采用的基因治療方法a.基因修飾腫瘤細(xì)胞“疫苗”療法 2b. 基因修飾TIL的過繼免疫療法 將細(xì)胞因子導(dǎo)入TIL細(xì)胞中，活化后的TIL具有顯著抗自身腫瘤的作用，回輸體仙后有聚集于腫瘤部位的傾向，攜帶的抗癌免疫增強(qiáng)性細(xì)胞因子基因在腫瘤局部表達(dá)量增加，同時(shí)還避免全身大劑量投用IL-2、TNF-等細(xì)胞因子所引起的嚴(yán)重毒副反應(yīng)。目前已將TNF-基因?qū)隩IL，并在癌癥患者中進(jìn)行臨床試驗(yàn)。 27腫瘤基因治療的基本策略和常用方法b. 基因修飾TIL的過繼免疫療法27腫瘤基因治療的基本策略c. 免疫增強(qiáng)基因療法 是將MHC1類抗原基因經(jīng)體內(nèi)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，

19、增加其免疫原性，有效地激活機(jī)體抗癌免疫反應(yīng)，降低腫瘤細(xì)胞的致瘤性。 d. 原位修飾腫瘤免疫原性的基因療法 直接在體內(nèi)原位修飾腫瘤免疫原性，誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒反應(yīng)，同時(shí)腫瘤組織的CTL可產(chǎn)生一種“旁觀者效應(yīng)”(bystander effect),即CTL不僅可以殺傷轉(zhuǎn)導(dǎo)基因陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，還可以殺傷轉(zhuǎn)導(dǎo)基因陰性腫瘤細(xì)胞，使受基因治療的瘤灶消退時(shí)，其他未治療的瘤灶也會(huì)消退。 28腫瘤基因治療的基本策略和常用方法c. 免疫增強(qiáng)基因療法 28腫瘤基因治療的基本策略和常用方法e. 癌基因拮抗療法 腫瘤的發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活有關(guān)，可以通地阻斷癌基因的表達(dá)或恢復(fù)抑癌基因的功能來抑制腫瘤的發(fā)展或恢復(fù)其正常表型。 29