西索米星(Sisomicin)菌種工藝規(guī)程

1、原料藥事業(yè)部*生物工程有限公司題目：西索米星(Sisomicin)菌種工藝規(guī)程第1頁共11頁制定人：黃啟鵬日期：編碼：STP-JZGY-005-01審核人：日期：生效日期：批準(zhǔn)人：日期：頒發(fā)部門：質(zhì)量部分發(fā)部門：生產(chǎn)副總、總工程師、生產(chǎn)部、質(zhì)量保證部、菌種中心l目的建立一個(gè)西索米星菌種工藝規(guī)程，供菌種中心人員統(tǒng)一操作，并作為制定相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序的依據(jù)。適用范圍菌種中心西索米星菌種生產(chǎn)工藝。責(zé)任者菌種中心操作人員，菌種中心、生產(chǎn)部、品保部負(fù)責(zé)人，總工程師對(duì)此工藝規(guī)程負(fù)責(zé)。目錄1產(chǎn)品概述22原材料質(zhì)量規(guī)格43生化反應(yīng)及工藝流程圖54工藝過程及質(zhì)量控制65菌種保存86菌種選育87主要設(shè)備一覽表0-T

2、OC o 1-5 h z8技術(shù)安全及防火9附頁10修訂簡(jiǎn)歷產(chǎn)品概述西索米星(Sisomicin)是美國先令公司在70年代開發(fā)的一種廣譜抗生素，屬氨基糖苷類，以其為母核可合成另一種新抗生素奈替米星(Netilmicin),它具有療效好，副作用小的特點(diǎn)。與大多數(shù)抗生素一樣，西索米星也是一種由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，國外多由伊尼奧氏小單孢菌發(fā)酵產(chǎn)生；國產(chǎn)西索米星是由福建省微生物研究所篩選得的伊尼奧氏小單孢菌澄江變種產(chǎn)生。目前我公司主要生產(chǎn)菌種為Y系列白色變株，其發(fā)酵生物效價(jià)可達(dá)1450u/ml抗生素名稱西索米星化學(xué)名稱O3一去氧一4一C一甲基一3一甲胺基一B-L阿拉伯糖吡喃糖基(14)O2,6

3、一二氨基一2,3,4,6四去氧一a一D甘油基一4一烯己吡喃糖基一(1一6)一2一去氧一L一鏈霉胺結(jié)構(gòu)式NHCH3西索米星及其主要小組分、衍生物R1R2R3合成方式西索米星HC-3-OH-H生物合成主組分奈替米星HC-3-OH-CH2_5半合成抗生素66-40BHOH-H生物合成小組分抗生素66-40DHOH-H生物合成小組分主要產(chǎn)品產(chǎn)品名稱分子式分子量西索米星堿(用于半合成)c19H37N5O7447.72硫酸西索米星(C19H37N5O7)2.5H2sO41385.43硫酸奈替米星(C21H41N5O7)2.5H2sO41441.54抗菌譜西索米星是一種廣譜抗菌素，與慶大霉素(Gentami

4、cin)相似，對(duì)G+細(xì)菌(除鏈霉菌)，包括結(jié)核分枝桿菌的活性很強(qiáng)。對(duì)G-細(xì)菌，包括多數(shù)綠膿桿菌具有相當(dāng)活性。Neti對(duì)一些G-桿菌都有較強(qiáng)抗菌活性。原材料質(zhì)量規(guī)格生化試劑（分析純或化學(xué)純）2.2工業(yè)（規(guī)格）序號(hào)原材料名稱規(guī)格控制項(xiàng)目質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1土豆淀粉工業(yè)外觀含量水分潔白的粉末，具有光澤。78%37.0%12%冷榨：9%13%熱榨：72%4酵母粉工業(yè)外觀干燥失重蛋白質(zhì)灰份淡黃色至淺黃棕色顆?；蚍勰?.5%44.0%8%5蛋白胨工業(yè)外觀水分總氮淺黃色至土黃色粉末13.0%6其他7碳酸鈣工業(yè)外觀含量白色粉末97.0%生化反應(yīng)及工藝流程圖化學(xué)反應(yīng)過程(西索米星生物合途徑)2一去氧鏈霉胺a巴龍霉胺b.慶

5、大霉素A21c抗生素JI20A.e慶大霉素X2慶大霉素A1,fg西索米星h抗生素6640B(的加入口一葡萄糖胺小)加入口一葡萄糖C3/：N一甲基胺化C4/：甲基化和差向異物化C6/：胺化(f)失去3/,4/-(OH)和4/-5/-不飽化C6/：胺化和4/-5/-不飽化C4/：甲基化和差向異物化3.2工藝流程圖冷凍管341A48冷凍管341A482h搖瓶發(fā)酵斜面120h34156d生產(chǎn)能力測(cè)定種子341C卜并瓶車間一級(jí)罐482h3.3設(shè)備流程圖備注：（a）（e）冷凍管（b）250ml備注：（a）（e）冷凍管（b）250ml母瓶種子1000ml菌絲瓶（用于車間進(jìn)罐）（c）500ml茄子瓶斜面（d）

6、500ml種子瓶（f）250500ml發(fā)酵搖瓶4工藝過程及質(zhì)量控制4.1各種培養(yǎng)基配比（%）原料名稱固體培養(yǎng)基（%）搖瓶種子培養(yǎng)基（%）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（）土豆淀粉1.52.06.0葡萄糖0.50.5K2HPO40.05干酪素0.20.2玉米漿1.0MgSO40.05酵母粉0.10.5CaCO30.50.60.6瓊脂粉2.3黃豆餅粉3消前pH7.10.17.10.1PH自然4.2生產(chǎn)能力測(cè)定控制適當(dāng)?shù)木g（鏡檢菌絲著色均勻，伸展，以10%的接種量移入發(fā)酵瓶，332深層培養(yǎng)110130小時(shí)止，放瓶。同時(shí)測(cè)定放瓶pH,并鏡檢菌絲形態(tài)，估計(jì)生物效價(jià)。用HSO酸化pH2.0以下手搖24勻后放置20分鐘，

7、用新華1號(hào)濾紙過濾。濾液可進(jìn)行生物測(cè)定，測(cè)定生產(chǎn)能力，或者濾液用KOH回調(diào)至pH7.0左右,再過濾的濾液用于生產(chǎn)能力測(cè)定。4.3裝量規(guī)格名稱種子瓶發(fā)酵瓶固體斜面瓶子規(guī)格500ml500ml250ml茄子瓶試管裝量規(guī)格90ml80ml80ml17ml通氣量每只棉塞2.5克兩層紗布內(nèi)包一層絨布棉花做成的棉塞4.4生產(chǎn)用供種斜面的制備在控制無菌情況下，吸0.71.0ml母瓶種子液，均勻涂在空白茄子瓶斜面上。塞好棉塞，扎好牛皮紙，放置341間培養(yǎng)56天后，收起來于4冰箱確定符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后備用。生產(chǎn)用菌絲瓶的制備取1個(gè)孢子子斜面用挖塊法將菌苔塊移入裝有90ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶?jī)?nèi)。341培養(yǎng)4

8、8h,觀察外觀顏色及結(jié)合鏡檢情況，符合種子質(zhì)量要求的可并瓶用于生產(chǎn)。符合質(zhì)量要求的10小瓶（500ml三角瓶裝90ml量）并為1大瓶，并根據(jù)外觀、無試、鏡檢確認(rèn)無菌，符合質(zhì)量要求可用于生產(chǎn)。質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)各級(jí)工藝控制點(diǎn)項(xiàng)目工藝控制點(diǎn)供種斜面培養(yǎng)溫度：341培養(yǎng)時(shí)間56天保存溫度：4冰箱使用期限W45天搖瓶種子（菌絲瓶）培養(yǎng)溫度341;培養(yǎng)時(shí)間482hr裝量500ml裝90ml培養(yǎng)基通氣量：每只棉塞2.5克搖瓶機(jī)轉(zhuǎn)速220240rpm偏心距25mm4.6.2各級(jí)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目要求項(xiàng)目質(zhì)量要求供種斜面外觀姜黃色生物效價(jià)800u/ml無菌檢查無雜菌搖瓶種子（菌絲瓶）外觀姜黃色鏡檢菌絲形態(tài)菌絲伸展成疏

9、松大叢，菌絲著色均勻，伸展。無菌度鏡檢及無菌試驗(yàn)無雜菌5菌種保存（采用冷凍管保存）為了防止生產(chǎn)菌種形態(tài)和生產(chǎn)能力的變異，以保持菌種的原始形態(tài)和特定的生產(chǎn)能力。所以菌種的保存具有重要性。目前菌種保存方法中，甘油保存較簡(jiǎn)便、適用，故我公司采用此法。冷凍管制備將18義200山口試管，1211滅菌25分鐘，備用。冷凍管保藏菌種在無菌室內(nèi)以嚴(yán)密的無菌操作，吸取6ml種子液，移入已滅菌的試管中。塞好橡膠塞，粘上膠布，并搖勻菌液每支試管均貼上標(biāo)簽，注明品種、菌號(hào)、日期，然后送入冰箱，深冷18至25保藏。6菌種選育篩選程序（流程）STP-JZGY-005-00西索米星STP-JZGY-005-00西索米星(S

10、isomicin)菌種工藝規(guī)程第 頁共11頁出發(fā)的.株西索米星（SisOmicin）菌種工藝規(guī)程STP-JZ出發(fā)菌株（100左右）（有時(shí)含底物）篩20株邛瓶/株稀樣液虢有破埼珠的A泡式浮夜誘變謊語出發(fā)的.株西索米星（SisOmicin）菌種工藝規(guī)程STP-JZ出發(fā)菌株（100左右）（有時(shí)含底物）篩20株邛瓶/株稀樣液虢有破埼珠的A泡式浮夜誘變謊語挑選菌落”數(shù)初篩第9頁共11頁1瓶/株24株凍受_高產(chǎn)埋冷凍管*_抱子斜血進(jìn)罐考查分離和篩選菌懸液的制備選好出發(fā)菌株的斜面，用無菌吸管將10ml生理鹽水吸入斜面，用竹簽將菌苔輕輕刮下，倒入裝有玻璃珠的小三角瓶?jī)?nèi)，塞上棉塞，置搖瓶機(jī)振打30分鐘后，取下用

11、裝有6層擦鏡紙的漏斗過濾。濾液用作純化或誘變處理。菌種純化將菌懸液，按10倍的稀釋法，逐一稀釋至10-310-6，從適當(dāng)濃度的稀釋管中吸取0.05-0.2ml于事先備好的瓊脂平板上,用刮棒均勻地涂勻;然后移入341培養(yǎng)。培養(yǎng)開始一周應(yīng)每天將平皿轉(zhuǎn)個(gè)方向（保證長出菌落分布均勻），并且在培養(yǎng)過程中注意觀察和做好記錄。待平皿上形成彼此分離的單菌落，挑取一定量菌落移入斜面（一菌落移入一斜面），移入341培養(yǎng)68天，初篩后取10%復(fù)篩，確定2-4株效價(jià)高的埋冷凍管，并做傳代試驗(yàn)。同時(shí)測(cè)定產(chǎn)物活性（組分變化情況）。最后確定遺傳性狀穩(wěn)定菌株留作生產(chǎn)備用。最后是培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調(diào)整。一個(gè)突變株由于基因突變，

12、失去生理特性的平衡，同時(shí)也降低了原來環(huán)境條件的適應(yīng)能力。所以對(duì)突變株選擇適應(yīng)環(huán)境至關(guān)重要。作為生產(chǎn)菌株必須是優(yōu)良菌株：具有高產(chǎn)性能（相對(duì)而言）、遺傳性狀穩(wěn)定、生產(chǎn)能力強(qiáng)、產(chǎn)孢子豐富、發(fā)酵性能好、周期短、有效組分高、廣泛適應(yīng)環(huán)境條件等。誘變物理誘變、化學(xué)誘變、復(fù)合因子處理等方法與純化操作所不同的是利用誘變劑處理微生物，以誘變?cè)斐赏蛔?，微生物菌種突變的頻率比自發(fā)突變有大幅度提高。物理誘變劑較廣泛應(yīng)用的有紫外線、X射線、快中子等。化學(xué)誘變劑種類繁多，常用的有硫酸二乙酯、乙烯亞胺、亞硝酸、5氟尿嘧啶、氮芥等。絕大多數(shù)化學(xué)誘變劑具有毒性，其中90以上是致癌物質(zhì)或極毒藥品，使用時(shí)要格外小心，不要直接用口吸

13、，要避免與皮膚直接接觸，也要防止污染環(huán)境，造成公害。7主要設(shè)備一覽表設(shè)備名稱型號(hào)規(guī)格數(shù)量備注用途SWCJ1CU5蘇凈科研實(shí)驗(yàn)無菌凈化臺(tái)SWCJ2G2蘇凈無菌室生產(chǎn)雙目日本產(chǎn)顯微鏡1鏡檢CH20OlympusDHG-9123A型1上海*實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司電熱鼓風(fēng)箱GZX-DH-30X351上海*醫(yī)療器械廠搖瓶機(jī)ZHWY-3122c500ml8上海智城深層液體培養(yǎng)ZHWY-31221000ml8山東魯抗深層液體培養(yǎng)超低溫冰箱COOL1存放斜面、試SC-2381電冰箱KQ-101劑、沙土管等13C-50E1離心機(jī)臺(tái)式802型1上海*器械廠離心圓形臥式壓力蒸汽滅菌器RZZ滬-065-20061上海*儀器有限公司滅菌酸度計(jì)pHS25型1上海測(cè)定pH技術(shù)安全及防火技術(shù)安全包括防火知識(shí)，是企業(yè)每個(gè)職工必備常知。它關(guān)系到國家財(cái)產(chǎn)的安全，也關(guān)系到每個(gè)人的生命安危。工作人員工作時(shí)要保證工作環(huán)境整潔（一周一次大掃除，每天安排值日生負(fù)責(zé)當(dāng)天事宜），堅(jiān)持工作崗位，嚴(yán)格執(zhí)行崗位安全操作法，嚴(yán)防事故發(fā)生。禁止在轉(zhuǎn)動(dòng)的設(shè)備上（搖瓶機(jī)、離