基因的重組與轉(zhuǎn)移

1、基因的重組與轉(zhuǎn)移第1頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞第六章 基因的重組與轉(zhuǎn)移 第2頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二第3頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5端磷酸與3-OH連到一起。第一節(jié) DNA片段的體外連接第4頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二1. 兩段DNA的連接依靠粘性末端第5頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二2. DNA片段與載

2、體的連接依靠粘性末端第6頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二第7頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二ligasenick第8頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二二、齊平末端（blunt end）的連接5端與3端并列靠近的時(shí)間太短，不容易被連接酶連接。1. 直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的10%。5 5 5 5 3 3 3 3 -OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3 -OH-PP-HO-5 3 第9頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二1972年，斯坦福大學(xué)的P. L

3、abban和P. Kaiser提出。（1）同聚加尾法 2. 人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒(méi)有模板的情況下給DNA的3-OH端加上脫氧核苷酸。原理：分別給載體和插入片段加上互補(bǔ)的核苷酸。加尾堿基互補(bǔ)第10頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來(lái)目的基因和載體加尾長(zhǎng)度不同，需補(bǔ)齊；不能把插入片段再切下來(lái)。非酶切位點(diǎn)第11頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二用T4 DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個(gè)人工粘性末端。（2）銜接物(linker)連接 linker用化學(xué)合成法合成的一段10-12b

4、p的特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。GGAATTCC CCTTAAGGEcoRI linker： linker的作用第12頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二 第13頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二 第14頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二缺點(diǎn)：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來(lái)。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段2）能給載體連接上Polylinker:優(yōu)點(diǎn)：第15頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二（3）DNA接頭 (adapter)連接法1978年康內(nèi)爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。

5、5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 BamHI adapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。 adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。 adapter的作用第16頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG -GGCCCTAG-P5 5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC

6、-P5 接頭自我連接第17頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二第18頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二接頭與接頭會(huì)彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。缺點(diǎn)：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5端的磷酸，防止自我連接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）防止自我連接第19頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5 接頭之間不

7、能形成磷酸二酯鍵自我連接！ 5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5 CIP處理-OHHO-第20頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5HO-GATCCCGG- HO-GGCC CCGG-OH -GGCCCTAG-OH5 5 HO-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-OH5 切口切口HO-OHCIP處理T4 ligase雖然有切口，但仍然能與DNA片段連接。第21頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)

8、26分，星期二三、PCR產(chǎn)物的連接1. 在引物的5端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)；（1）設(shè)計(jì)原則（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu)3端1520bp與模板互補(bǔ)； 5端610bp是某個(gè)內(nèi)切酶的識(shí)別序列。（5端多余的35bp起保護(hù)堿基作用）避免與所擴(kuò)增的DNA片段內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。第22頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二引物1GCAGAATTC 互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5-3 GCAGAATTC 互補(bǔ)序列5-3 3 模板GCAGAATTC 互補(bǔ)序列 PCR產(chǎn)物5-3 3 復(fù)性延伸模板模板3 3 第23頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二GCTAGCCGG

9、 互補(bǔ)序列模板BamH I 位點(diǎn)-5 3- 5 復(fù)性延伸模板模板3 3 GCTAGCCGG 互補(bǔ)序列-5 3-模板5 GCTAGCCGG PCR產(chǎn)物 互補(bǔ)序列-5 3-引物2第24頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC PCR產(chǎn)物5-3 GCTAGCCGG PCR產(chǎn)物-5 3-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)AATTC PCR產(chǎn)物5-3 GCTAG PCR產(chǎn)物-5 3-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個(gè)粘性末端！第25頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二2. 與T載體直接連接（1

10、）PCR產(chǎn)物兩個(gè)3端一般都有一個(gè)ATaq DNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3端再加上一個(gè)多余的核苷酸（優(yōu)先加A）。（2）平末端載體兩個(gè)3端各加一個(gè)T利用Taq DNA聚合酶，當(dāng)原料中只有dTTP時(shí)，被迫在平端載體3端上添加T！第26頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA第27頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)插入片段與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進(jìn)行非粘性末端連接。第28頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，2

11、2點(diǎn)26分，星期二EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個(gè)堿基的粘性末端。第29頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二2. DNA插入的方向正確（1）用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI第30頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二3. 插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時(shí)候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGG

12、AATTCT插入片段EcoRIEcoRIATGGAATTC T重組但移碼突變！第31頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二4. 防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片段的用量連接反應(yīng)體系中，插入片段比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片段以單鏈連接。5 3 載體插入片段第32頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二1. 載體自身環(huán)化連接（能存活）2. 載體之間互相連接（能存活）3. 插入片段互相連接（不能存活）4. 一個(gè)載體與幾個(gè)插入片段重組（能存活）五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果5. 幾個(gè)

13、載體與一個(gè)插入片段重組（能存活）第33頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二17第34頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二1. 目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。第二節(jié) 重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備第35頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2. 菌種第36頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二第37頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3. 制備原理第38頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月

14、20日，22點(diǎn)26分，星期二4. 制備過(guò)程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至On ice 5-10 min4離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4離心收集菌4離心收集菌分裝、-70 凍存（15%甘油）用冰冷的60mMCaCl2重懸On ice 30 min用冰冷的60mMCaCl2重懸第39頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過(guò)程。（2）轉(zhuǎn)染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過(guò)程。1. 外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)借助噬菌體把外源

15、DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。第40頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。 3. 轉(zhuǎn)化方法 2. 轉(zhuǎn)化率簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）。（1）熱休克法（heat shock）轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）。（2）電轉(zhuǎn)化法第41頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二10ng載體DNA100L感受態(tài)菌 On ice混合，靜置10分鐘42C 1分鐘加入1mL LB培養(yǎng)基37搖1小時(shí)10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法第42頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二L

16、B培養(yǎng)受體菌至OD600冰浴15分鐘，2 離心集菌冰冷的水重懸菌體2 離心集菌冰冷的水重懸菌體2 離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成 50-300L 電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV脈沖控制器200-400 0.5g質(zhì)粒DNA On ice混合加入1mL培養(yǎng)液37中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)化法第43頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二4. 平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37過(guò)夜第44頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二環(huán)形重組質(zhì)粒 質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片段進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）

17、重組質(zhì)粒 5. 影響轉(zhuǎn)化率的因素第45頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二生長(zhǎng)狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌。必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70以下CaCl2處理使用感受態(tài)菌時(shí)必須梯度融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細(xì)胞 （competent cells) 第46頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。6. 體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）體外包裝（in vitro packaging） （2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduct

18、ion）通過(guò)受體菌細(xì)胞表面的DNA接受器位點(diǎn)（receptor site)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。第47頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二cI857基因是個(gè)溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在32下培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)能夠保持溶源性。 但當(dāng)溫度升高到4445時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。（3）cI857基因突變的噬菌體 但由于該噬菌體的S基因上有一個(gè)突變，所以細(xì)菌還不裂解。 S和R是控制寄主細(xì)菌發(fā)生溶菌作用的兩個(gè)基因，故稱溶菌基因。 第48頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星

19、期二cI857其它基因溶源狀態(tài)（DNA不轉(zhuǎn)錄、不翻譯）DNA阻遏 蛋白活性阻遏 蛋白失活4445DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯合成外殼蛋白32第49頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二噬菌體1外殼蛋白基因E發(fā)生了無(wú)義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突變的噬菌體的基礎(chǔ)上，選擇兩種外殼蛋白的突變型噬菌體。 （4） 互補(bǔ)型噬菌體 外殼蛋白基因D發(fā)生了無(wú)義突變，不能合成頭部的包裝識(shí)別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部、尾部蛋白）。噬菌體2第50頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二(5) 體外包裝過(guò)程 第51頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，

20、5月20日，22點(diǎn)26分，星期二體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA能形成106噬菌斑）。 （6） 轉(zhuǎn)導(dǎo) 第52頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二轉(zhuǎn)化率高的菌株； 有突變的菌株（與導(dǎo)入的載體基因互補(bǔ)）； 不育的菌株（不會(huì)與其他酵母接合）。第三節(jié) 外源基因?qū)胝婧思?xì)胞一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞1. 菌株選擇如：ura3-52, trp1-289, leu2-3, leu2-112, his31第53頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二（1）利用原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化 2. 酵母的轉(zhuǎn)化方法 酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、

21、 PEG插入外源基因 的酵母載體PEG（聚乙二醇） CaCl2使細(xì)胞膜具有通透性，允許DNA進(jìn)入。 轉(zhuǎn)化第54頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二 酵母0.1mol/L LiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài)40% PEG 4000（2）利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化第55頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡看護(hù)培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、導(dǎo)入植物細(xì)胞1. 葉盤法（leaf disk)第56頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV電壓擊愈傷組織幼苗分化2

22、. 電擊法（electroporation)第57頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二外源基因選擇標(biāo)記基因電擊通過(guò)膜上的小孔吸入DNADNA進(jìn)入細(xì)胞核選擇穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞擯棄不表達(dá)或表達(dá)不穩(wěn)定的細(xì)胞第58頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二又稱高速微型子彈射擊法（High-velocity microprojectiles)DNA1.2m鎢彈頭 吸附特制手槍射擊植物裝入3.基因槍法（gene gun） 第59頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二第60頁(yè)，共67頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)26分，星期二（1）原理：三、導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞1.