分子遺傳學(xué) (2)課件

1、第七章 RNA遺傳DNARNAProtein圖7. 1 中心法則示意圖 (DNA與RNA:誰(shuí)是誰(shuí)的模板？）7.1 RNA世界生命早期的遺傳物質(zhì)RNA世界假說(shuō)(RNA world hypothesis)認(rèn)為在生命進(jìn)化早期沒(méi)有蛋白質(zhì)酶，某些RNA序列可以催化RNA的復(fù)制。也就是說(shuō)，RNA是生命早期的唯一遺傳物質(zhì)，它是生命的源頭。在RNA遺傳的基礎(chǔ)上，才有了后來(lái)的DNA與蛋白質(zhì)體系。事實(shí)上，RNA的遺傳作用并未在生命的進(jìn)化中消失，在一定的程度上，RNA仍在支配著DNA與蛋白質(zhì)的命運(yùn)。Biologists hypothesize that early in lifes history, RNA occ

2、upied center stage and performed most jobs in the cell, storing genetic information, copying itself, and performing basic metabolic functions. This is the RNA world hypothesis. Today, these jobs are performed by many different sorts of molecules (DNA, RNA, and proteins, mostly), but in the RNA world

3、, RNA did it all. 某種RNA分子能夠催化RNA復(fù)制中的多聚化Johnston W. K.等的工作證明某種RNA分子確實(shí)能夠催化RNA復(fù)制中的多聚化。它使用NTP及RNA模板的編碼信息使RNA引物(RNA primer)持續(xù)增加14個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，等于RNA螺旋的一圈。這種多聚化是RNA模板依賴(lài)的，是按照引物的序列、長(zhǎng)度，以及RNA模板的信息進(jìn)行的，證明了引物的3是在與RNA模板逐一地、嚴(yán)格地配對(duì)的情況下進(jìn)行的。結(jié)果，多聚化過(guò)程是逼真的；在引物被擴(kuò)展11個(gè)核苷酸的情況下，對(duì)此等序列進(jìn)行了克隆和序列分析，在1100個(gè)樣品中有1088個(gè)是與模板準(zhǔn)確匹配的。(B) 含有l(wèi)igase

4、ribozyme的隨機(jī)RNA序列備用池。(C）round-10 ribozyme, (D) round-18 ribozyme圖7.2 Ribozymes的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型(A) ribozyme能促進(jìn)有限的RNA多聚化。它使用NTPs及適當(dāng)模板(3XXXXXXXXXAUAUCGG5）的編碼信息來(lái)擴(kuò)展RNA引物(5 XXXXXX3）。Ribozyme能使用四種RNA核苷酸中的任何一種（以X表示）來(lái)使引物與模板配對(duì)。但是，模板的5區(qū)必須與Ribozyme的3區(qū)配對(duì)才能發(fā)揮Ribozyme的作用。變性膠電泳7.2 RNA干涉 RNA Interference ( RNAi )RNAi（RNA inte

5、rference）是指在生物體細(xì)胞內(nèi)，dsRNA引起同源mRNA的特異性降解，因而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的過(guò)程。RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。RNAi在生物體內(nèi)普遍存在,是抵御外在感染的重要保護(hù)機(jī)制。RNAi的發(fā)展歷程1995，RNAi現(xiàn)象首次在線(xiàn)蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)。Cell，1995 ，81：611-6201998，RNAi概念的首次提出。Nature, 1998, 391（6669）：8061999，RNAi作用機(jī)制模型提出。Cell，2000，101（1）：25-33 在線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅、擬南芥及斑馬魚(yú)等多種生物內(nèi)發(fā)現(xiàn)R

6、NAi現(xiàn)象。2001，RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象。Nature，2001，411（6836）：494498 RNAi技術(shù)被Science評(píng)為2001年度的十大科技進(jìn)展之一。2002至今，有關(guān)RNAi的研究蓬勃開(kāi)展，是分子生物學(xué)領(lǐng)域最為熱門(mén)的方向之一。 C.elegans life cycle at 22C (artwork by Altun and Hall, Wormatlas) 預(yù)備知識(shí)dsRNA：雙鏈RNA，包含有義鏈和反義鏈Dicer：屬于RNase III 家族，是dsRNA的特異性核酸內(nèi)切酶。siRNA：small interfering RNA ，RNAi

7、的關(guān)鍵效應(yīng)分子，21-23個(gè)nt大小的雙鏈RNA。RISC：RNA-inducing silencing complex，具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活性。RdRP：RNA-dependent RNA polymerases，是RNAi的調(diào)節(jié)因子，使RNAi可以在生物體內(nèi)傳遞。/focus/rnai/index.htmlGisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.“異常的”“外源的”“病毒的”“轉(zhuǎn)位子的”內(nèi)切酶次級(jí)RNAi引發(fā)的基因沉默機(jī)制線(xiàn)蟲(chóng)、真菌和植物 果蠅和哺乳動(dòng)物細(xì)胞 RNAi的研究方法siRNA的制備方法體外制備 -化學(xué)合成siR

8、NA -體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA -用RNase 消化長(zhǎng)片段dsRNA得到siRNA體內(nèi)表達(dá) -利用質(zhì)粒或病毒載體表達(dá)siRNA Plasmid ApproachAmbion Inc. Austin, Texas, USARNAi技術(shù)的應(yīng)用基因功能研究 對(duì)特定基因進(jìn)行功能喪失或降低突變，以確定其功能。 基因治療 -病毒感染，HIV病毒、肝炎病毒等 -腫瘤疾病，將siRNA導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞其它應(yīng)用 -植物代謝 -細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路 2004年，RNAi在罌粟中成功應(yīng)用?？纱蛲╟odeine）與嗎啡（morphine）具有共同的前體分子(S)-網(wǎng)狀香荔枝堿（reticuline），這種生物堿治療瘧疾等

9、疾病很有功效。植物代謝采用RNAi技術(shù)抑制可待因酮還原酶基因家族中所有基因的表達(dá)，使(S)-網(wǎng)狀香荔枝堿和甲基-(S)-網(wǎng)狀香荔枝堿大量積聚。基因改良使罌粟不產(chǎn)嗎啡改治病，為增加植物中高藥用價(jià)值的生物堿產(chǎn)量提供了成功的案例。Nat Biotechnol，2004，22（12）：1559-1566(S)-網(wǎng)狀香荔枝堿嗎啡（可待因酮）RNAi的研究方法 / / / 寶生物工程 (大連) 有限公司 (大連TaKaRa公司) microRNA (微小分子RNA, miRNA)miRNA是一類(lèi)分布廣泛的內(nèi)源性不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA分子，大約由2125個(gè)核苷酸組成，成熟的miRNA 5端有一磷酸基團(tuán),

10、 3端為羥基。過(guò)去miRNA曾被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)多余的垃圾RNA，但近年發(fā)現(xiàn)它們是調(diào)控真核細(xì)胞基因表達(dá)的關(guān)鍵分子，影響著多種細(xì)胞生物現(xiàn)象。miRNA 的表達(dá)具有組織和時(shí)期特異性, 而且其中一些基因在進(jìn)化上有很高的保守性。許多證據(jù)表明miRNA在細(xì)胞中起著調(diào)控基因表達(dá)的重要作用。2002年美國(guó)Science雜志評(píng)出的年度十大科技突破中, miRNA的發(fā)現(xiàn)名列榜首。目前miRNA已成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)。7.4 RNA編輯（RNA editing）RNA編輯是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的插入(insertion)、刪除(deletion)或替換(substitution)等現(xiàn)象。1986

11、年R. Benne在研究錐蟲(chóng)(trypanosome)線(xiàn)粒體mRNA轉(zhuǎn)錄加工時(shí)發(fā)現(xiàn)mRNA的多個(gè)編碼位置上插入或刪除了尿苷酸(U)。錐蟲(chóng)線(xiàn)粒體中轉(zhuǎn)錄的許多RNA均缺少成熟RNA中存在的核苷酸。1990年在高等動(dòng)物和病毒中也發(fā)現(xiàn)了RNA編輯現(xiàn)象。RNA編輯是在RNA的水平改變遺傳信息的，而且往往會(huì)增加一些原來(lái)DNA模板中不曾編碼的堿基。RNA編輯同RNA選擇剪接 (alternative splicing)一樣，使得一個(gè)基因序列有可能產(chǎn)生幾種不同的蛋白質(zhì)。Functional consequences of RNA editing模糊基因 ( cryptogenes ) Simpson與Shaw

12、把被RNA編輯的基因稱(chēng)之為模糊基因，也稱(chēng)為“隱秘基因”，并把模糊基因分為三種類(lèi)型：類(lèi)型：內(nèi)部編輯的模糊基因。如cox，只在其轉(zhuǎn)錄 本的蛋白質(zhì)編碼區(qū)內(nèi)部進(jìn)行編輯。類(lèi)型：5端編輯的模糊基因。如CYb等，只在其轉(zhuǎn)錄本的5端蛋白質(zhì)編碼區(qū)內(nèi)進(jìn)行編輯。類(lèi)型：泛編輯的模糊基因(pan-edited cryptigenes)。如cox泛編輯（Panediting）。Figure 7.18 Part of the mRNA sequence of T. brucei cox shows many uridines that are not coded in the DNA (shown in red) or t

13、hat are removed from the RNA (shown as T).在錐蟲(chóng)cox mRNA上158個(gè)位點(diǎn)插入了394核苷酸；在9個(gè)位點(diǎn)刪去了18個(gè)尿苷酸，實(shí)際增加了376個(gè)核苷酸，使cox的長(zhǎng)度增加了55%，因此coxIII的基因比成熟的mRNA小了很多，故稱(chēng)其隱秘基因或模糊基因。錐蟲(chóng)線(xiàn)粒體的cox 基因 RNA編輯的酶切模型（Simpson model）Figure 7.21 Addition or deletion of U residues occurs by cleavage of the RNA, removal or addition of the U, and l

14、igation of the ends. The reactions are catalyzed by a complex of enzymes under the direction of guide RNA.細(xì)胞可在那些從隱秘基因轉(zhuǎn)錄的前體RNA分子中插入許多U核苷酸，由指導(dǎo)RNA（guide RNA）規(guī)定插入的位置。指導(dǎo)RNA（RNA編輯的模板）都比較短，可與前體RNA堿基配對(duì)，并在相對(duì)于插入的位置含有腺苷酸（A）。RNA編輯的轉(zhuǎn)酯模型（Cech model）1991年Cech等又提出了以gRNA和被編輯前體RNA配對(duì)，由寡聚U進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的模型。 RNA編輯具有以下特點(diǎn)(1) RNA編輯從病毒到原生動(dòng)物到哺乳動(dòng)物以至植物，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄本到細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄本，普遍存在于生命界的各種遺傳系統(tǒng)中。(2) RNA編輯對(duì)基因的加工幅度可大于序列的50；它通過(guò)對(duì)pre-mRNA核苷酸的添加、刪除、替換而完成從起始密碼、終止密碼的設(shè)置到移