酶工程制藥醫(yī)學宣教培訓課件

1、酶工程制藥醫(yī)學宣教酶工程制藥醫(yī)學宣教國際酶工程學會（1971年）定義： 酶工程是研究和開發(fā)酶的生產(chǎn)、酶的分離純化、酶的固定化、酶及固定化酶的反應器、酶與固定化酶的應用等的工程科學。 2酶工程制藥醫(yī)學宣教2酶工程制藥醫(yī)學宣教 酶工程制藥主要包括藥用酶的生產(chǎn)和酶法制藥兩方面的技術。藥用酶是指可用于預防和治療疾病的酶。 酶法制藥是指利用酶的催化作用而制造出具有藥用功效的物質(zhì)的技術過程. 藥用酶：酶法制藥：3酶工程制藥醫(yī)學宣教 酶工程制藥主要包括藥用酶的生產(chǎn)和酶法制藥兩方面的技術。第一節(jié) 概述 酶是生物催化劑。是由活細胞產(chǎn)生的以蛋白質(zhì)為主要成分的生物催化劑，它能催化各種生物化學反應。4酶工程制藥醫(yī)學宣

2、教第一節(jié) 概述 酶是生物催化劑。是由活細胞產(chǎn)生的以蛋白一、酶的催化特性催化劑的共同點量少高效；只加速可逆反應的進程，而不改變反應的平衡點。都是通過降低反應分子的活化能來加快化學反應的速度。酶的特性高效催化高度專一條件溫和5酶工程制藥醫(yī)學宣教一、酶的催化特性催化劑的共同點5酶工程制藥醫(yī)學宣教1、酶的專一性強 酶的專一性（specificity)：是指一種酶只能催化一種或一類結構相似的底物進行某種類型的反應。6酶工程制藥醫(yī)學宣教1、酶的專一性強 酶的專一性（specificity)絕對專一性(absolute specificity)：只能作用于特定結構的底物，進行一種專一的反應，生成一種特定結構

3、的產(chǎn)物 。 立體結構特異性(stereo specificity)：作用于立體異構體中的一種。相對專一性(relative specificity)：作用于一類化合物或一種化學鍵。根據(jù)酶對其底物結構選擇的嚴格程度不同，酶的專一性可大致分為以下2種類型：7酶工程制藥醫(yī)學宣教絕對專一性(absolute specificity)：只能2、酶的催化效率高 酶的催化效率通常比非催化反應高1081020倍，比一般催化劑高1071013倍。酶和一般催化劑加速反應的機理都是降低反應的活化能(activation energy)。酶比一般催化劑更有效地降低反應的活化能。 8酶工程制藥醫(yī)學宣教2、酶的催化效率高

4、 酶的催化效率通常比非催化反應高8酶工程制3、酶的作用條件溫和 酶的催化不需要較高的反應溫度。 酶的催化作用一般都在常溫、常壓、pH近乎中性的溫和條件下進行，不需高溫高壓和極端pH條件。 9酶工程制藥醫(yī)學宣教3、酶的作用條件溫和 酶的催化不需要較高的反應溫度。9二、影響酶催化作用的主要因素1、酶濃度對酶促反應的影響在有足夠底物和其他條件不變的情況下： v = k E酶促反應的速度與酶濃度成正比10酶工程制藥醫(yī)學宣教二、影響酶催化作用的主要因素1、酶濃度對酶促反應的影響在有足2、底物濃度對酶促反應的影響SvVmax一級反應 v = k S零級反應 v = k E混合級反應11酶工程制藥醫(yī)學宣教2

5、、底物濃度對酶促反應的影響SvVmax一級反應零級反應當?shù)孜餄舛容^低時反應速度與底物濃度成正比；反應為一級反應。SVVmax12酶工程制藥醫(yī)學宣教當?shù)孜餄舛容^低時反應速度與底物濃度成正比；反應為一級反應。隨著底物濃度的增高反應速度不再成正比例加速；反應為混合級反應。SVVmax13酶工程制藥醫(yī)學宣教隨著底物濃度的增高反應速度不再成正比例加速；反應為混合級反應當?shù)孜餄舛雀哌_一定程度反應速度不再增加，達最大速度；反應為零級反應SVVmax14酶工程制藥醫(yī)學宣教當?shù)孜餄舛雀哌_一定程度反應速度不再增加，達最大速度；反應為零3、pH對酶促反應的影響1.最適pH 2.有效pH表現(xiàn)出酶最大活力的pH值在一定

6、的pH范圍內(nèi)酶是穩(wěn)定的pH對酶作用的影響機制：1.環(huán)境過酸、過堿使酶變性失活；2.影響酶活性基團的解離；3.影響底物的解離。0酶活性 pH pH對某些酶活性的影響 胃蛋白酶 淀粉酶 膽堿酯酶 24681015酶工程制藥醫(yī)學宣教3、pH對酶促反應的影響1.最適pH 2.有效pH表現(xiàn)出酶雙重影響溫度升高，酶促反應速度升高；由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應速度降低 。 4、溫度對酶促反應的影響最適溫度 (optimum temperature)：酶促反應速度最快時的環(huán)境溫度。其不是酶的特征性常數(shù)酶活性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 溫度 C 溫

7、度對淀粉酶活性的影響 16酶工程制藥醫(yī)學宣教雙重影響4、溫度對酶促反應的影響最適溫度 (optimum 5、激活劑對酶促反應的影響激活劑使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|(zhì)。其中大部分是一些無機離子和小分子簡單有機物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-等；無機離子對酶的激活作用：（1）與酶分子肽鏈上的側鏈基團相結合，穩(wěn)定酶催化作用所需的構象。（2）作為底物與酶蛋白之間聯(lián)系的橋梁。（3）可能作為輔酶或輔基的一個組成部分，協(xié)助酶的催化作用。17酶工程制藥醫(yī)學宣教5、激活劑對酶促反應的影響激活

8、劑17酶工程制藥醫(yī)學宣教使用激活劑注意激活劑對酶的作用具有一定的選擇性，使用不當，會適得其反，激活劑之間有時存在拮抗現(xiàn)象。激活劑的濃度有一定的范圍，超出此范圍，會得到相反的效果。18酶工程制藥醫(yī)學宣教使用激活劑注意激活劑對酶的作用具有一定的選擇性，使用不當，會6、抑制劑對酶促反應的影響使酶的必需基團或活性部位中的基團的化學性質(zhì)改變而降低酶活力甚至使酶失活的物質(zhì)，稱為抑制劑（I）。（1）. 不可逆抑制作用：抑制劑與酶的結合（共價鍵）是不可逆的。S + EESE + P + IEIESH +ICH2COOH ESCH2COOH + HI 抑制作用特點：不可逆性抑制，抑制劑濃度越高，抑制作用時間越長

9、，抑制作用越強。19酶工程制藥醫(yī)學宣教6、抑制劑對酶促反應的影響使酶的必需基團或活性部位中的基（2）可逆抑制作用：抑制劑與酶的結合是可逆的。抑制程度是由酶與抑制劑之間的親和力大小、抑制劑的濃度以及底物的濃度決定。Ev1231. 反應體系中不加I。2.反應體系中加入一定量的不可逆抑制劑。3.反應體系中加入一定量的可逆抑制劑。20酶工程制藥醫(yī)學宣教（2）可逆抑制作用：抑制劑與酶的結合是可逆的。抑制程度是由酶Ev不可逆抑制劑的作用Ev 可逆抑制劑的作用I I 21酶工程制藥醫(yī)學宣教Ev不可逆抑制劑的作用Ev 可逆抑制劑的作用I競爭性抑制作用：抑制劑和底物競爭與酶結合。特點：1）抑制劑和底物競爭酶的結

10、合部位。2）抑制程度取決于I和S的濃度以及與酶結合的 親和力大小。3）競爭性抑制劑的結構與底物結構十分相似。S + EESE + P + IEI22酶工程制藥醫(yī)學宣教競爭性抑制作用：抑制劑和底物競爭與酶結合。特點：S + 非競爭性抑制作用：底物和抑制劑同時與酶結合，但形成的EIS不能進一步轉變?yōu)楫a(chǎn)物。S + EESE + P + IEI + IEIS+SE+P特點：1）隨著抑制劑濃度I的增加，抑制作用增強。2）底物濃度的增減對抑制作用不產(chǎn)生影響。3）抑制劑不改變酶對底物的親和力。 23酶工程制藥醫(yī)學宣教非競爭性抑制作用：底物和抑制劑同時與酶結合，但形成的EIS反競爭性抑制作用：I與酶和底物的中

11、間復合物結合而不與游離酶結合，從而抑制酶活性。S + EESE + P + IEISE+P特點：1）隨著抑制劑濃度I的增加，抑制作用增強。2）底物濃度的增減對抑制作用不產(chǎn)生影響。3）抑制不改變酶對底物的親和力。 24酶工程制藥醫(yī)學宣教反競爭性抑制作用：I與酶和底物的中間復合物結合而不與游離酶三、酶的分類與命名（一）、酶的命名1、習慣名：命名原則如下（ 1.）根據(jù)酶的底物命名。（2.）根據(jù)所催化的反應的性質(zhì)命名。（3.）有的酶結合上述兩個原則命名。（4.）在這些基礎上有時還加上酶的來源或酶的其它特點。25酶工程制藥醫(yī)學宣教三、酶的分類與命名（一）、酶的命名1、習慣名：命名原則如下2、系統(tǒng)名：要求

12、能確切表明底物的化學本質(zhì)及酶的性質(zhì)，包括兩部分，即底物名稱及反應類型，底物間用“：”分開，若底物之一是水則可略去不寫。ATP+CH3COOH ADP+CH3COP其系統(tǒng)名為：ATP：乙酸磷酸轉移酶26酶工程制藥醫(yī)學宣教2、系統(tǒng)名：要求能確切表明底物的化學本質(zhì)及酶的性質(zhì)，包括兩部（二）、酶的分類根據(jù)反應性質(zhì)分為六大類1、氧化還原酶類：催化氧化還原反應，涉及H 和電子的轉移。如脫氫酶類。2、轉移酶類：催化分子間功能基團的轉移。如轉氨酶類。27酶工程制藥醫(yī)學宣教（二）、酶的分類根據(jù)反應性質(zhì)分為六大類27酶工程制藥醫(yī)學宣教3水解酶類：催化水解反應。如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶等。4裂合酶類：催化非

13、水解地除去底物分子中的基團及其逆反應的酶。如醛縮酶脫氨酶 脫羧酶28酶工程制藥醫(yī)學宣教3水解酶類：催化水解反應。如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶5異構酶類：催化同分異構體的相互轉變。6、合成酶：與ATP 分解相偶聯(lián)，并由二種物質(zhì)合成一種物質(zhì)。如天冬酰胺合成酶 丙酮酸羧化酶29酶工程制藥醫(yī)學宣教5異構酶類：催化同分異構體的相互轉變。29酶工程制藥醫(yī)學宣 在每一大類酶中，又根據(jù)底物中被作用的基團或鍵的特點分為若干亞類，然后再把屬于某一亞類、亞亞類的酶按順序排好，這樣把已知的酶分門別類地排成一個表，叫做酶表。類 亞類 亞亞類 序號30酶工程制藥醫(yī)學宣教 在每一大類酶中，又根據(jù)底物中被作用的基團或鍵的

14、特點分如 EC1.1.1.27 為乳酸：NAD+氧化還原酶 EC1.1.1.37 為蘋果酸：NAD +氧化還原酶 EC1.1.1.1 為乙醇：NAD +氧化還原酶31酶工程制藥醫(yī)學宣教如 EC1.1.1.27 為乳酸：NAD+氧化還原酶31酶一些酶的命名舉例32酶工程制藥醫(yī)學宣教一些酶的命名舉例32酶工程制藥醫(yī)學宣教四、酶活力及其測定 酶的定量并非對其蛋白質(zhì)進行定量，而是對它的催化能力進行定量。所以，酶的定量就是測定酶的活力，也即測定酶促反應的速度。33酶工程制藥醫(yī)學宣教四、酶活力及其測定 酶的定量并非對其蛋白質(zhì)進行1. 酶活力及測定 酶活力 是酶促反應的能力。酶活力大小就是指在一定條件所催化

15、的某一化學反應速度的快慢，即酶催化的反應速度越快，酶活力越高，反之則表示該酶活力低。 34酶工程制藥醫(yī)學宣教1. 酶活力及測定 酶活力 是酶促反應的能力酶活力測定 酶活力測定包括兩個階段。首先要在一定條件下，將酶與其作用底物混合均勻，反應一段時間，然后再測定反應液中底物或產(chǎn)物變化的量。步驟：（1）根據(jù)酶的專一性，選擇適宜的底物，并配置成一定濃度的底物溶液。 （2）根據(jù)資料或試驗結果，確定酶催化反應的溫度、pH值等條件。 （3）在一定的條件下，將一定量的酶液與一定量的底物溶液混合均勻，記錄開始的時間。（4）反應到一定的時間，取出適量的反應液運用各種適合的生化檢測技術，測定產(chǎn)物的生成量或底物的減少

16、量。 35酶工程制藥醫(yī)學宣教酶活力測定 酶活力測定包括兩個階段。首先要在一定條件下， 反應時間一到，立即取出一定量的反應液，置于沸水浴中，加熱使酶失活。 立即加入適宜的酶變性劑，如三氯醋酸等，使酶變性失活。 立即加入酸或堿溶液，使反應液的pH值迅速遠離酶促反應的最適pH值，從而終止反應。 將取出的反應液立即置于冰粒堆或冰鹽溶液中，使反應液的溫度迅速降低到10以下。 常用的終止酶反應的方法：36酶工程制藥醫(yī)學宣教 反應時間一到，立即取出一定量的反應液，置于沸水浴2. 酶活力單位 酶活力單位(1961年)：在特定條件下，每分鐘催化1微摩爾底物轉化為產(chǎn)物的酶量，定義為一個酶活力單位，用U表示。 特定

17、條件是指：溫度可采用25或其他選用的溫度，其它條件均采用最適條件。37酶工程制藥醫(yī)學宣教2. 酶活力單位 酶活力單位(1961年)：在特定條3. 酶的比活力指每毫克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù)比活力 酶活力單位數(shù)（U）酶蛋白質(zhì)量（mg）比活力是酶制劑純度的常用指標 比活力越大，表示酶越純。38酶工程制藥醫(yī)學宣教3. 酶的比活力指每毫克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù)比活力 第二節(jié) 藥 用 酶 的 生 產(chǎn) 39酶工程制藥醫(yī)學宣教 第二節(jié) 39酶工程制藥醫(yī)學宣教一、藥用酶的種類1、 蛋白酶:蛋白酶目前可用作：(1)消化劑(2)消炎劑(3)治療高血壓40酶工程制藥醫(yī)學宣教一、藥用酶的種類1、 蛋白酶:蛋白酶目前

18、可用作：(1)消化劑 -淀粉酶水解淀粉生成糊精，是國際上廣泛使用的消化藥。最早采用米曲霉生產(chǎn)的復合 -淀粉酶，其中還含有蛋白酶、脂肪酶等多種酶。但由于米曲霉 -淀粉酶的適宜pH值為4.56.0所以在胃中易受胃酸破壞。用黑曲霉酸性淀粉酶作為消化藥，不易受胃酸破壞，效果會更好。2 、-淀粉酶41酶工程制藥醫(yī)學宣教 -淀粉酶水解淀粉生成糊精，是國際上廣泛使 脂肪酶催化脂肪水解生成甘油和脂肪酸，可作為消化劑使用。 假單胞菌脂肪酶能分解血液中的低密度脂白和乳糜微粒，可用于預防和治療高血脂病。3、 脂肪酶42酶工程制藥醫(yī)學宣教 脂肪酶催化脂肪水解生成甘油和脂肪酸，可3、 該酶水解右旋糖酐生成小分子產(chǎn)物，對

19、齲齒有顯著的預防效果 。 齲齒是一種常見的口腔疾病，其病因是由于口腔中的細菌將蔗糖合成結構類似右旋糖酐的粘性多糖，粘附在牙齒表面，引起細菌滋生，而使牙齒受到損壞。將右旋糖酐酶應用到牙膏，可有效防治齲齒的產(chǎn)生。4 、右旋糖酐酶43酶工程制藥醫(yī)學宣教 該酶水解右旋糖酐生成小分子產(chǎn)物，對齲齒有4 、 溶菌酶具有抗菌，消炎，鎮(zhèn)痛等療效，是一種廣泛應用的藥用酶 。 溶菌酶作用于細菌的細胞壁，使其受到破壞，而使病原菌、腐敗性細菌等溶解死亡。 溶菌酶與抗生素聯(lián)合使用，可顯著提高抗生素的療效.5、 溶菌酶44酶工程制藥醫(yī)學宣教5、 溶菌酶44酶工程制藥醫(yī)學宣教 SOD催化超氧負離子（O-2）進行氧化還原反應生

20、成氧和雙氧水。（2 O-2+2H+H2O2+O2） 由于SOD能清除體內(nèi)的超氧負離子，具有抗氧化、抗輻射、抗衰老的功效，保護機體內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)和細胞膜等免遭超氧負離子的破壞，對紅斑狼瘡、皮膚炎、結腸炎、白內(nèi)障、風濕性關節(jié)炎、氧中毒等疾病有顯著療效，對輻射有防護作用。6、 超氧化物歧化酶(SOD)45酶工程制藥醫(yī)學宣教 SOD催化超氧負離子（O-2）進行氧化還6、 Asn Asp+NH3 抗癌藥物 癌細胞不含天冬酰胺合成酶,本身不能合成L-天冬酰胺，而外源的L-Asn又被加入的L-天冬酰胺酶分解掉，因此，蛋白質(zhì)的合成受阻，從而導致癌細胞死亡。7、L-天冬酰胺酶46酶工程制藥醫(yī)學宣教Asn A

21、sp+NH3 抗癌藥物7、L-鏈激酶：-溶血性鏈球菌產(chǎn)生的一種蛋白酶，可 催纖維蛋白酶原，激活成纖維蛋白酶而 將纖維蛋白水解使血栓溶解。 尿激酶：從尿液中分離得到的一種蛋白酶，具有溶 解血栓的療效，其副作用比鏈激酶小。 納豆激酶：由納豆桿菌或枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的一種 蛋白酶，具有溶解血栓的功效，可以口服。 8、溶栓酶47酶工程制藥醫(yī)學宣教8、溶栓酶47酶工程制藥醫(yī)學宣教9、乳糖酶 乳糖酶又稱-半乳糖苷酶，它催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖。 乳糖酶可用于治療乳糖酶缺乏癥。 48酶工程制藥醫(yī)學宣教9、乳糖酶 乳糖酶又稱-半乳糖苷酶，它催化乳糖水解生 運用各種生化分離技術，從動物、植物及微生物等的含酶

22、細胞、組織或器官中提取、分離和純化各種藥用酶的方法稱為提取法。二、 藥用酶的生產(chǎn)方法1、 提取法：49酶工程制藥醫(yī)學宣教二、 藥用酶的生產(chǎn)方法1、 提取法：49酶工程制藥醫(yī)學宣教 利用各種動物、植物和微生物細胞的生命活動而獲得人們所需的酶的方法稱為生物合成法。 主要是利用微生物細胞進行生產(chǎn)。2 、生物合成法：50酶工程制藥醫(yī)學宣教 利用各種動物、植物和微生物細胞的生命活動而獲得人們所 化學合成法是60年代中期出現(xiàn)的新技術。 1965年，我國人工合成胰島素的成功，開辟了蛋白質(zhì)化學合成的新紀元。 3 、化學合成法: 1969年，美國首次用化學合成法得到含有124個氨基酸的核糖核酸酶。 化學合成法合

23、成的成本高昂，且只能合成已知化學結構的酶, 至今停留在實驗室階段。 51酶工程制藥醫(yī)學宣教3 、化學合成法: 1969年，美國首次用化學 通過篩選、誘變或采用基因工程、細胞工程等技術而獲得。三 、藥用酶生產(chǎn)細胞的選擇用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的細胞必須具備的條件：1、 酶的產(chǎn)量高52酶工程制藥醫(yī)學宣教 通過篩選、誘變或采用基因工程、三 、藥用酶生2、 容易培養(yǎng)和管理 適應性較強，易于生長繁殖，便于管理。3、 產(chǎn)酶穩(wěn)定性好 不易退化，能穩(wěn)定地用于生產(chǎn)。4 利于酶的分離純化 胞外酶5 、安全可靠53酶工程制藥醫(yī)學宣教2、 容易培養(yǎng)和管理5 、安全可靠53酶工程制藥醫(yī)學宣教常用的產(chǎn)酶微生物有： 枯草芽孢桿菌（B

24、acillus subtilis）大腸桿菌（Escherichia coli）黑曲霉（Aspergillus niger）米曲霉（Aspergillus orizae）木霉（Trichoderma）青霉（penicillium）根霉（Rhizopus）毛霉（Mucor）鏈霉菌（Streptomyces）啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）假絲酵母（Candida）54酶工程制藥醫(yī)學宣教常用的產(chǎn)酶微生物有： 枯草芽孢桿菌（Bacillus sub 對于誘導酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適當?shù)恼T導物，可使產(chǎn)酶量顯著提高 。 四、 提高藥用酶產(chǎn)量的措施1 、添加誘導物：55

25、酶工程制藥醫(yī)學宣教 對于誘導酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適當?shù)恼T導 不同的酶有各自不同的誘導物。然而有時一種誘導物可誘導生成同一酶系的若干種酶，如-半乳糖苷可同時誘導-半乳糖苷酶、透過酶和-半乳糖乙酰化酶3種酶(協(xié)同誘導)。 同一種酶往往有多種誘導物，實際應用時可根據(jù)酶的特性、誘導效果和誘導物的來源等方面進行選擇。56酶工程制藥醫(yī)學宣教 不同的酶有各自不同的誘導物。然而有時一種誘導（1）酶作用的底物：乳糖誘導-半乳糖苷酶 青霉素誘導青霉素酶（2）酶的反應產(chǎn)物：半乳糖醛酸誘導果膠酶 纖維二糖誘導纖維素酶 沒食子酸誘導單寧酶誘導物的種類：57酶工程制藥醫(yī)學宣教誘導物的種類：57酶工程制藥醫(yī)學宣

26、教 酶的最有效的誘導物。 如：IPTG（異丙基-D-硫代半乳糖苷）對-半乳糖苷酶的誘導效果比乳糖高幾百倍；蔗糖甘油單棕櫚酸酯對蔗糖酶的誘導效果比蔗糖高幾十倍等。（3）酶的底物類似物:58酶工程制藥醫(yī)學宣教 酶的最有效的誘導物。（3）酶的底物類似 分解代謝物阻遏 阻遏作用 產(chǎn)物反饋阻遏 末端產(chǎn)物 阻遏物 酶催化反應產(chǎn)物 分解代謝物控制阻遏濃度是解除阻遏、提高酶產(chǎn)量的有效措施。2 、控制阻遏物濃度59酶工程制藥醫(yī)學宣教2 、控制阻遏物濃度59酶工程制藥醫(yī)學宣教 末端產(chǎn)物阻遏：可通過控制末端產(chǎn)物的濃度使阻遏解除。 酶催化反應產(chǎn)物阻遏：可通過控制酶催化反應產(chǎn)物的濃度使阻遏解除。解除： 分解代謝物阻遏，

27、可通過下列方法解除：控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度補料分次流加碳源添加一定量的CAMP。60酶工程制藥醫(yī)學宣教 末端產(chǎn)物阻遏：可通過控制末端產(chǎn)物的濃度使阻遏 陽離子型 離子型 陰離子型表面活性劑 兩性離子型 非離子型 3、 添加表面活性劑61酶工程制藥醫(yī)學宣教3、 添加表面活性劑61酶工程制藥醫(yī)學宣教 由于離子型表面活性劑有些對細胞有毒害作用，不能用于酶的發(fā)酵生產(chǎn)。 非離子型表面活性劑，如Tween、Triton等，可積聚在細胞膜上，增加細胞的通透性，有利于酶的分泌，所以可增加酶的產(chǎn)量。 此外，添加表面活性劑有利于提高某些酶的穩(wěn)定性和催化能力。62酶工程制藥醫(yī)學宣教 由于離子型表面活

28、性劑有些對細胞有毒害作用，不產(chǎn)酶促進劑：是指可以促進產(chǎn)酶，但作用機理 并未闡明清楚的物質(zhì)。添加產(chǎn)酶促進劑往往對提高酶產(chǎn)量有顯著效果。4、 添加產(chǎn)酶促進劑63酶工程制藥醫(yī)學宣教4、 添加產(chǎn)酶促進劑63酶工程制藥醫(yī)學宣教五、 藥用酶的分子修飾1、 酶分子修飾： 通過各種方法使酶分子結構發(fā)生 某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的過程稱為酶分子修飾。64酶工程制藥醫(yī)學宣教五、 藥用酶的分子修飾1、 酶分子修飾： 通過各種方法 提高酶活力，增加酶的穩(wěn)定性，消除或降低酶的抗原性。2、 酶分子修飾的目的：65酶工程制藥醫(yī)學宣教2、 酶分子修飾的目的：65酶工程制藥醫(yī)學宣教 通過改變酶分子中所含的金屬離子，

29、使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法稱為金屬離子置換修飾，簡稱為離子置換法。 3、酶分子修飾技術(方法)(1)金屬離子置換修飾：66酶工程制藥醫(yī)學宣教 通過改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生 金屬離子置換修飾法只適用于本來在結構中含有金屬離子的酶。 用于酶修飾的金屬離子，往往是二價金屬離子，如：Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等。67酶工程制藥醫(yī)學宣教 用于酶修飾的金屬離子，往往是酶液+EDTA等金屬螯合劑EDTA-金屬螯劑用透析、超濾、分子篩等方法除去失活酶液+其他金屬離子酶活力升高，穩(wěn)定性增強。金屬離子置換修飾過程：68酶工程制藥醫(yī)學宣教酶液+EDTA等金

30、屬螯合劑EDTA-金屬螯劑用透析、超濾例：鋅型蛋白酶鈣型蛋白酶，酶活力提高2030%；-淀粉酶的鎂型、鋅型鈣型，穩(wěn)定性增強，酶活力提高3倍以上。69酶工程制藥醫(yī)學宣教例：鋅型蛋白酶鈣型蛋白酶，酶活力提高2030%；69酶工 利用水溶性大分子與酶結合，使酶的空間結構發(fā)生某些精細的改變，從而改變酶的特性與功能的方法稱為大分子結合修飾法。(2)大分子結合修飾:70酶工程制藥醫(yī)學宣教(2)大分子結合修飾:70酶工程制藥醫(yī)學宣教 右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等，這些大分子在使用前一般需經(jīng)過活化，然后在一定條件下與酶分子以共價鍵結合，對酶分子進行修飾。大分子修飾劑：71酶工程制藥醫(yī)學宣教

31、 右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等，這 大分子結合修飾的作用： 水溶性大分子通過共價鍵與酶分子結合后，可使酶的空間結構發(fā)生某些改變，使酶的活性中心更有利于和底物結合，并形成準確的催化部位，從而使酶活力得以提高。 .例：每分子胰蛋白酶用11分子的右旋糖酐修飾后， 酶活力可提高30%等。、通過修飾提高酶活力：72酶工程制藥醫(yī)學宣教 大分子結合修飾的作用： 水溶性大 酶的穩(wěn)定性用半衰期來表示。酶的半衰期：是指酶的活力降低到原來一半時所 經(jīng)過的時間。 、通過修飾增加酶的穩(wěn)定性： 用可溶性大分子與酶結合進行酶分子修飾，可在酶的外圍形成保護層，使酶的空間構象免受其他因素的影響，從而增加酶的

32、穩(wěn)定性，延長其半衰期。73酶工程制藥醫(yī)學宣教 酶的穩(wěn)定性用半衰期來表示。、通過修飾增加、通過修飾降低或消除抗原性 抗體與抗原之間的特異結合是由于它們之間特定的分子結構所引起的。采用酶分子修飾方法使酶的結構產(chǎn)生某些改變，就有可能降低甚至消除其抗原性。例：聚乙二醇結合修飾后的L-天冬酰胺酶， 其抗原性可完全消除。74酶工程制藥醫(yī)學宣教、通過修飾降低或消除抗原性 抗體與抗原之間 要想獲得理想的修飾效果，必須確定最佳修飾劑的種類和濃度、溫度、pH值和反應時間。75酶工程制藥醫(yī)學宣教 要想獲得理想的修飾效果，必須確定最佳修飾劑的種類和濃（3）肽鏈有限水解修飾 酶蛋白的肽鏈被水解后，可能會出現(xiàn)以下3種情況

33、中的一種： 酶活性中心被破壞，失去催化功能； 肽鏈的一部分水解后，仍可維持活性中心的完整構象，則酶的活力仍可保持或損失不多； 肽鏈的一部分水解除去以后，有利于活性中心與底物的結合，酶活力提高。 在后兩種情況下，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進行，稱為肽鏈有限水解 。76酶工程制藥醫(yī)學宣教（3）肽鏈有限水解修飾 酶蛋白的肽鏈被水解后， 利用肽鏈的有限水解，使酶的空間結構發(fā)生某些精細的改變，從而改變酶的特性和功能的方法，稱為肽鏈有限水解修飾。肽鏈有限水解修飾：77酶工程制藥醫(yī)學宣教 利用肽鏈的有限水解，使酶的空間結構發(fā)生某些精 有些酶原來不顯示酶活力或酶活不高，利用某些具有高度專一性的蛋白酶對它進行肽鏈

34、有限水解修飾，除去一部分肽段或若干個氨基酸殘基，就可使其空間構象發(fā)生改變，有利于活性中心與底物結合并形成準確的催化部位，從而顯示出酶的催化活性或提高其酶活力。肽鏈有限水解修飾作用：、顯示或提高酶活力78酶工程制藥醫(yī)學宣教 有些酶原來不顯示酶活力或酶活不高，利用某些具有 有些酶原來具有抗原性，這除了酶的結構特點以外，還由于酶是大分子。 蛋白質(zhì)的抗原性與其分子大小有關，大分子的外源蛋白質(zhì)往往出現(xiàn)較強的抗原性，而小分子的肽鏈或蛋白質(zhì)，其抗原性較低或者無抗原性。所以，若將酶分子經(jīng)肽鏈有限水解，其分子量減小，就會在保持其酶活力的前提下，使酶的抗原性降低，甚至消失。 、降低抗原性：79酶工程制藥醫(yī)學宣教

35、有些酶原來具有抗原性，這除了酶的結構特點、 酶蛋白側鏈基團就是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團。 通過改變酶蛋白側鏈基團而使蛋白質(zhì)空間結構發(fā)生某些改變，從而引起酶的特性和功能改變的方法稱為酶蛋白側鏈基團修飾。 (4)酶蛋白側鏈基團修飾：80酶工程制藥醫(yī)學宣教(4)酶蛋白側鏈基團修飾：80酶工程制藥醫(yī)學宣教氨基修飾劑：能使酶蛋白側鏈上的氨基發(fā)生改變的化合物。 主要有：二硝基氟苯、醋酸酐、亞硝酸等。羧基修飾劑：可與酶蛋白側鏈上的羧基反應的小分子化合物。 主要有：乙醇-鹽酸試劑、水溶性的碳化二亞胺等 胍基修飾劑：可與酶蛋白側鏈上的胍基縮合生成穩(wěn)定雜環(huán)的 化合物。 一般是二羰基化合物。主要有：環(huán)己

36、二酮、乙二醛、苯乙二醛等。 常用的小分子側鏈基團的修飾劑：81酶工程制藥醫(yī)學宣教氨基修飾劑：能使酶蛋白側鏈上的氨基發(fā)生改變的化合物。 蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基側鏈中含有巰基。巰基在許多酶中充當活性中心的催化基團，巰基可與另一巰基形成二硫鍵，對維持酶的結構穩(wěn)定性起重要作用。 常用的有二硫蘇糖醇、疏基醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉等還原劑以及各種?；瘎?、烷基化劑等。 巰基修飾劑：82酶工程制藥醫(yī)學宣教 蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基側鏈中含有巰基。巰基在許多酶中充蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上含有酚基。酚基修飾法有：碘化法、硝化法和琥珀?；ǖ?。 經(jīng)酚基修飾劑修飾后，酚分子由于引入負電荷，因而增加了對帶正電荷的底物的結合力，有

37、利于酶催化功能的發(fā)揮。 酚基修飾劑：分子內(nèi)交聯(lián)劑： 用含有雙功能團的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等與酶分子內(nèi)兩個側鏈基團反應，在分子內(nèi)共價交聯(lián)，可使酶分子空間構象更加穩(wěn)定，從而也使酶的催化穩(wěn)定性增加。 83酶工程制藥醫(yī)學宣教蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上含有酚基。酚基修飾劑：分子內(nèi)交聯(lián)劑：（5）氨基酸置換修飾 通過氨基酸置換修飾，可以提高酶活力或增加酶的穩(wěn)定性，更有利于酶的應用。 將肽鏈上的某一氨基酸進行置換而引起酶蛋白空間構象的某些改變，從而改變酶的某些特性和功能，這種修飾方法，稱為氨基酸置換修飾。 84酶工程制藥醫(yī)學宣教（5）氨基酸置換修飾 通過氨基酸置換修飾，可以提高酶活 通過各種物理方法

38、，使酶分子的空間構象發(fā)生改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法稱為物理修飾。 （6）物理修飾：特點：不改變酶的組分和基團，酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變，只是在物理方法的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。85酶工程制藥醫(yī)學宣教 通過各種物理方法，使酶分子的空間（6）物理第三節(jié)藥 物 的 酶 法 生 產(chǎn)86酶工程制藥醫(yī)學宣教第三節(jié)86酶工程制藥醫(yī)學宣教 用在半合成抗生素生產(chǎn)上。催化青霉素或頭孢霉素水解生成6氨基青霉烷酸（6APA）或7氨基頭孢霉酸（7ACA）。又可催化?；磻?APA合成新型青霉素或由7ACA合成新型頭孢霉素。一、藥物的酶法生產(chǎn)中所用酶的種類1、青霉素?；福捍呋瘋孺湹乃夂秃铣?/p>

39、87酶工程制藥醫(yī)學宣教 用在半合成抗生素生產(chǎn)上。催化青霉素或頭孢霉化學反應式88酶工程制藥醫(yī)學宣教化學反應式88酶工程制藥醫(yī)學宣教 不同來源的青霉素?；笇囟群蚿H值的要求不同。同一來源的青霉素?；冈诖呋夥磻痛呋铣煞磻獣r所要求的條件各不相同，尤其是pH條件相差較大，操作時要控制好。一般說來，催化水解反應時，pH值為7.0 8.0,而催化合成反應時, pH值降低到5.0 7.0.89酶工程制藥醫(yī)學宣教 不同來源的青霉素酰化酶對溫度和pH值的要求不同。2、-酪氨酸酶 -酪氨酸酶可催化L-酪氨酸或鄰苯二酚生成二羥苯丙氨酸（DOPA，多巴）。 多巴：一種神經(jīng)傳遞介質(zhì)，治療帕金森氏綜合癥（英

40、國醫(yī)師Parkinson描述的一種大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變的老年性疾病）。-酪氨酸酶催化酪氨酸生成多巴的條件為： pH3.5-6.0，溫度30-55。另外，在催化轉化時要添加抗氧化劑， 90酶工程制藥醫(yī)學宣教2、-酪氨酸酶 -酪氨酸酶可催化L-酪氨酸 核苷中的核糖被阿拉伯糖取代可以形成阿糖苷。阿糖苷具有抗癌和抗病毒的作用。其中阿糖腺苷療效顯著。 阿糖腺苷（腺嘌呤阿拉伯糖苷）可由核苷磷酸化酶催化阿糖尿苷（尿嘧啶阿拉伯糖苷）轉化而成。而阿糖尿苷由尿苷（尿嘧啶核苷）通過化學方法轉化而成。3、核苷磷酸化酶：91酶工程制藥醫(yī)學宣教 核苷中的核糖被阿拉伯糖取代可以形成阿糖苷。 無色桿菌（Acbrcmoba

41、cter lydicus）蛋白酶可以特異性地催化胰島素B鏈羧基末端（第30位）上的AA置換反應，由豬胰島素（Ala-30） 人胰島素（Thr-30） ，以增加療效。4、無色桿菌蛋白酶： AA排列順序 A8 A9 A10 B30人 Thr Ser Ile Thr 豬 Thr Ser Ile Ala 92酶工程制藥醫(yī)學宣教 無色桿菌（Acbrcmobacter lydicu5、5-磷酸二酯酶 5-磷酸二酯酶催化核糖核酸水解生成四種5-核苷酸，5-核苷酸用于心臟疾病、肝臟疾病等的治療。93酶工程制藥醫(yī)學宣教5、5-磷酸二酯酶 5-磷酸二酯酶催化核糖 PNP酶 nNDP+RNAn RNAn+1+pi

42、6、多核苷酸磷酸化酶（PNP酶）PNP酶催化核苷二磷酸聚合生成多聚核苷酸。 式中NDP為核苷二磷酸， RNAn和 RNAn+1分別為含有n和n+1個核苷酸的多核苷酸。94酶工程制藥醫(yī)學宣教6、多核苷酸磷酸化酶（PNP酶）PNP酶催化核苷二磷酸聚合生 若以肌苷二磷酸（IDP）和胞苷二磷酸（CDP）為底物，通過酶的作用，可生成聚肌胞。 聚肌胞是一種高效的干擾素誘導劑，對慢性肝炎、帶狀皰疹、角膜炎等均有一定的療效。PNP酶可由大腸桿菌等多種菌株生產(chǎn)。95酶工程制藥醫(yī)學宣教 若以肌苷二磷酸（IDP）和胞苷二磷酸（ 1、根據(jù)欲制造的藥物的結構特點，選擇好原料、反應步驟及所使用的酶或酶系。 二、酶的選擇與

43、反應條件的優(yōu)化96酶工程制藥醫(yī)學宣教 1、根據(jù)欲制造的藥物的結構特點，選擇好原料、反應步驟 2、根據(jù)藥物的用途和要求，選擇的酶需經(jīng)過一定步驟進行純化，以達到產(chǎn)品的要求。97酶工程制藥醫(yī)學宣教 2、根據(jù)藥物的用途和要求，選擇的酶需經(jīng)過一定步驟進行 3、根據(jù)酶的反應動力學特點，確定并優(yōu)化反應的工藝條件，包括底物濃度、酶濃度、溫度、PH、激活劑的濃度等。98酶工程制藥醫(yī)學宣教 3、根據(jù)酶的反應動力學特點，確定并優(yōu)化反應的工藝條件 4、要求前體物質(zhì)達到一定的純度要求并廉價易得，以提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。99酶工程制藥醫(yī)學宣教 4、要求前體物質(zhì)達到一定的純度要求并廉價易得，以提高三、酶和菌體固定化

44、游離酶的不足： （1）酶的穩(wěn)定性較差，在溫度、PH值和無機離子等外界因素的影響下，容易變性失活。 （2）難于回收利用，不僅使成本較高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。 （3）酶反應后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，不利于產(chǎn)物的提純和精制。100酶工程制藥醫(yī)學宣教三、酶和菌體固定化 游離酶的不足： （1）酶的穩(wěn)定性固定化酶（Immobilized Enzyme） : 固定在載體上，并在一定范圍內(nèi)進行催化反應的酶稱為固定化酶。 將酶與水不溶性的載體結合，制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。 固定在載體上的菌體或菌體碎片稱為固定化菌體，它是固定化酶的一種形式。 101酶工程制藥醫(yī)學宣教固定化酶（Immobilized E

45、nzyme） : （一）酶和菌體固定化的方法 吸附法 包埋法 共價結合法 交聯(lián)法 102酶工程制藥醫(yī)學宣教（一）酶和菌體固定化的方法 吸附法102酶工程制藥醫(yī)學宣教吸附法 吸附法是通過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互作用而達到固定目的的方法。 103酶工程制藥醫(yī)學宣教吸附法 吸附法是通過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互物理吸附法(physical adsorption)是通過氫鍵、疏水鍵等作用力將酶吸附于不溶性載體的方法。常用的載體有：高嶺土、皂土、硅膠、氧化鋁、磷酸鈣膠、微空玻璃等無機吸附劑，纖維素、膠原以及火棉膠等有機吸附劑。 離子結合法(ion binding)是指在適宜的pH和離子

46、強度條件下，利用酶的側鏈解離基團和離子交換基間的相互作用而達到酶固定化的方法（離子鍵）。最常用的交換劑有CM-纖維素、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等；其他離子交換劑還有各種合成的樹脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑。根據(jù)吸附劑的特點分為兩種：104酶工程制藥醫(yī)學宣教物理吸附法(physical adsorption)是通過氫吸附法的優(yōu)點、缺點 優(yōu)點：操作簡單，可供選擇的載體類型多，吸附過程可同時達到純化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。 缺點：酶和載體的結合力不強，易脫落， 會導致催化活力的喪失和

47、沾污反應產(chǎn)物。105酶工程制藥醫(yī)學宣教吸附法的優(yōu)點、缺點 優(yōu)點：操作簡單，可供選擇酶工程制藥醫(yī)學宣教培訓課件 凝膠包埋法是將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中，制成一定形狀的固定化酶或固定化菌體。（1）、凝膠包埋法 聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 它的機械強度高，并可以改進酶脫落的情況，在包埋的同時使酶共價偶聯(lián)到高聚物上，可以減少酶的脫落。 海藻酸鈉也可以用來作為包埋載體，它從海藻中提取出來，可被多價離子Ca2+、Al3+凝膠化 ，操作簡單經(jīng)濟。 K-角叉萊膠（卡拉膠）冷卻成膠或與二、三價金屬離子成膠。包埋條件溫和無毒性，機械強度好。固定化的酶活回收率和穩(wěn)定性都比聚丙烯酰胺法好。 膠原和明

48、膠也是常用的包埋載體。107酶工程制藥醫(yī)學宣教 凝膠包埋法是將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中2、微囊化包埋法微囊法主要將酶封裝在膠囊、脂質(zhì)體和中空纖維中。膠囊和脂質(zhì)體主要用于醫(yī)學治療，中空纖維主要適于工業(yè)使用 。微囊制備方法（1）界面沉淀法是一種簡單的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有機相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。（2）界面聚合法是用化學手段制備微囊的方法。他所得的微囊外觀好，但不穩(wěn)定，有些酶還會因在包埋過程中發(fā)生化學反應而失活。（3）表面活性劑乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活性劑使之乳化形成液膜達到包埋目的的一種方法。 108酶工程制藥醫(yī)學宣教2、微囊化包埋

49、法微囊法主要將酶封裝在膠囊、脂質(zhì)體和中空纖維中包埋法的優(yōu)點、缺點 優(yōu)點：在于它是一種反應條件溫和、很少改變酶結構但是又較牢固的固定化方法。 缺點：是只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過高聚物網(wǎng)架擴散，對那些底物和產(chǎn)物是大分子的酶并不適合。這是由于高聚物網(wǎng)架會對大分子物質(zhì)產(chǎn)生擴散阻力導致固定化酶動力學行為改變，使活力降低。109酶工程制藥醫(yī)學宣教包埋法的優(yōu)點、缺點 優(yōu)點：在于它是一種反應條件溫和、很 共價結合法是目前研究中最為活躍的方法。 原理：借助共價鍵將酶的非活性必需側鏈基團和載體的功能基團進行偶連。3、共價結合（偶聯(lián)）法110酶工程制藥醫(yī)學宣教 共價結合法是目前研究中最為活躍的方法。 （ 1 ）載

50、體的性質(zhì)要求載體親水，并且有一定的機械強度和穩(wěn)定性，同時具備在溫和條件下與酶結合的功能基團。（ 2 ）偶聯(lián)反應的反應條件必須在溫和pH、中等離子強度和低溫的緩沖溶液中。（ 3 ）所選擇的偶聯(lián)反應要盡量考慮到對酶的其它功能基團副反應盡可能少。（ 4 ）要考慮到酶固定化后的構型，盡量減少載體的空間位阻對酶活力的影響。共價偶聯(lián)法中的幾個影響因素：111酶工程制藥醫(yī)學宣教（ 1 ）載體的性質(zhì)要求載體親水，并且有一定的機械強度和穩(wěn)定共價偶聯(lián)法的優(yōu)點、缺點： 優(yōu)點：得到的固定化酶結合牢固、穩(wěn)定性好、利于連續(xù)使用。 缺點：載體活化的操作復雜，反應條件激烈，需要嚴格控制條件才可以獲得較高活力的固定化酶。同時共價結合會影響到酶的空間構象，從而對酶的催化活性產(chǎn)生