植物科學(xué)最前沿-實驗方法步驟co ip

1、Co-ip protocol抗體選擇Anti-Myc: M4439, Monoclonal Anti-c-Myc antibody produced in mouse clone 9E10, purified immunoglobulin, buffered aqueous solution (Sigma)Anti-HA: H3663, HYPERLINK /catalog/product/sigma/h3663 t _blank Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouseclone HA-7, purified from hybridoma c

2、ell culture (Sigma)Anti-flag: F3165 or F1804 Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse clone M2, purified immunoglobulin, buffered aqueous solution (Sigma)Anti-GST: SAB2702378-Monoclonal Anti-GST tag antibody produced in mouse MYC純化介質(zhì)：A7470 , Anti-c-Myc Agarose Affinity Gel antibody produce

3、d in rabbit affinity isolated antibody (Sigma)HA純化介質(zhì)：A2095，Monoclonal Anti-HAAgarose antibody produced in mouse clone HA-7, purified immunoglobulin, PBS suspension (Sigma)Flag純化介質(zhì)：A2220, ANTI-FLAG M2 Affinity Gel，別名:ANTI-FLAGM2 Affinity Agarose Gel Anti-ddddk Anti-dykddddk Monoclonal ANTI-FLAGM2 ant

4、ibody produced in mouse。轉(zhuǎn)化煙草懸浮液：MES（pH5.7） 10 mM MgCl2 10 mM 乙酰丁香酮 150 uM2-3天后取樣，液氮速凍，備用。Ip，co-ip及western blot研缽磨碎煙草葉片，（總量約為1.5ml離心管尖部裝滿），加入300ul蛋白提取緩沖液，13000rpm，4，15min。取40ul 蛋白上清液，加入10ul 5*SDS loading buffer 混勻，沸水煮沸5min。放置到冰上，該蛋白為input。加入15ul anti-HA sepharose beads于剩余的蛋白上清中，用蛋白提取液補充至1ml，4孵育2h（這一步

5、為IP, 要放置在旋轉(zhuǎn)儀上，注意吸beads時候用進(jìn)口槍頭，防止殘留浪費，槍頭尖部剪掉）。500 rpm，4離心5min，棄上清。用蛋白提取緩沖液清洗beads，500 rpm，4離心5min，洗5次。第5次洗滌完剩余約40 ul 蛋白緩沖液，加入10ul 5*SDS loading buffer，沸水煮沸5min。（此步驟即為得到的ip和co-ip下來的蛋白）。Western blot 進(jìn)行蛋白檢測。（加樣時候可以加15ul input，10ul IP因為IP蛋白含量比較大, 25ul Co-ip,兩側(cè)的孔不要點樣，用SDS loading buffer補齊，maker點樣時候可以加入少許S

6、DS loading buffer，這樣跑出來更好看）用10%的SDS蛋白膠進(jìn)行電泳。90V 10min，150V 60min，此時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜緩沖液，-20冰箱中預(yù)冷。電泳完畢后截取與膠大小一致的PVDF膜一張，甲醇中激活15s，放置于轉(zhuǎn)磨緩沖液中備用。轉(zhuǎn)膜：按照以下順序放置好膠膜和膠：夾子負(fù)極、2層濾紙、膠、PVDF膜、2層濾紙。即所謂的三明治結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)膜儀放置于冰里，200mA，2h 或者100mA，4過夜。轉(zhuǎn)膜完畢可以用麗春紅染色input（用鑷子夾住放入染液立刻拿出來），看看轉(zhuǎn)膜效率。洗掉麗春紅。（麗春紅染色可以重復(fù)利用）。封閉：5%脫脂奶粉浸泡PVDF膜，室溫低速搖床，封閉2h，也可以4

7、過夜封閉。洗滌PVDF膜：TTBS 溶液洗滌，每次5min，共3次。一抗孵育：用5%脫脂奶粉稀釋的抗體浸泡PVDF膜，室溫低速搖床2h，也可以4過夜。（一張小膜6ml，sigma抗體1:3000稀釋，國產(chǎn)的可以自己摸索比例）洗滌PVDF膜：TTBS 溶液洗滌，每次5min，共5次。注意：洗滌次數(shù)和時間均可以延長。若所用一抗已經(jīng)過HRP標(biāo)記，可以直接進(jìn)行第17步驟。二抗孵育：用5%脫脂奶粉稀釋的抗體（GAM或者GAR，抗鼠或者抗兔，必須與一抗對應(yīng)）浸泡PVDF膜，室溫低速搖床1.5h。洗滌PVDF膜：TTBS 溶液洗滌，每次5min，共5次。注意：洗滌次數(shù)和時間均可以延長。蛋白顯影：取等量顯色液A和顯色液B，根據(jù)膜的大小而定，均勻涂抹在PVDF膜上，保鮮膜包好PVDF膜，將X膠片放在PVDF膜上，蓋好暗盒，根據(jù)蛋白濃度控制曝光時間，取出X片，顯影10s-10min，水洗，放入定影液進(jìn)行定影。附：總蛋白提取緩沖液（100ml）： Tris-Hcl（ph7.5） 50 mMNaCl 150 mMMgCl2 10 mMNP-40 0.1%DTT 3 mM (現(xiàn)用現(xiàn)加)100*Cocktail 1ml (現(xiàn)用現(xiàn)加)注：1片 羅氏 cocktail 加500 ul水溶解后即為100*Cocktail。轉(zhuǎn)膜緩沖液：2.9g 甘氨酸，5.8 g Tris, 200ml 甲醇，ddH2O定