細(xì)胞第三章課件

1、第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法Figure 3-1. Resolving power. Sizes of cells and their components drawn on a logarithmic scale, indicating the range of objects that can be readily resolved by the naked eye and in the light and electron microscopes. The following units of length are commonly employed in microscopy: m (m

2、icrometer) = 10-6 m nm (nanometer) = 10-9 m (ngstrm unit) = 10-10 m A. Resolution and magnification第一節(jié) 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)1、普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù) 普通光學(xué)顯微鏡（最大分辨率為0.2m），主要由三部分組成：光學(xué)放大系統(tǒng)，即目鏡和物鏡；照 明系統(tǒng)；機(jī)械和支架系統(tǒng)。 顯微鏡的性能優(yōu)劣決定于它的分辨率。分辨率是指顯微鏡區(qū)分開相近兩點(diǎn)的能力。 為光源波長(zhǎng)，為物鏡鏡口角 。 D=061N sin/2 2、熒光顯微鏡技術(shù) 在紫外光顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，利用樣品自發(fā)熒光和誘發(fā)熒光，可

3、以對(duì)某些生物大分子進(jìn)行定性和 定位研究。不僅可以觀察固定切片標(biāo)本，還可以在活體染色后對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行研究。 3、激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡 技術(shù) 共焦點(diǎn)是 指物鏡和聚光鏡同時(shí)聚焦到同一小點(diǎn)。它 在某一瞬間只用一束通過(guò)檢測(cè)器前的小孔的光成像，可顯著提高分辨率?？梢杂^察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。5Figure 3-5. Making tissue sections. How an embedded tissue is sectioned with a microtome in preparation for examination in the light microscope. B. Preparation o

4、f specimen取材固定脫水包埋切片脫蠟復(fù)水染色脫水透明封片觀察Figure 3-4. Edge effects. The interference effects observed at high magnification when light passes the edges of a solid object placed between the light source and the observer. 4、相差顯微鏡技術(shù)和微分干涉顯微鏡技術(shù) 光線在通過(guò)密度不同的介質(zhì)時(shí)，其滯留程度不同，即產(chǎn)生了光程差和相位差。相差顯微鏡 的基本原理把光程差變成振幅差(即明暗)。從而提高樣品反差

5、，故樣品不需染色，適合觀察活細(xì)胞。甚至研究細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器的動(dòng)態(tài)。它在結(jié)構(gòu)上與普通顯微鏡最大的不同是在物鏡后裝有相差板。 微分干涉顯微鏡用的是偏振光，增加了樣品反差，并具有立體感，可作于研究活體細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。 錄像增差顯微鏡技術(shù)在一定程度上可以填補(bǔ)光鏡與電鏡之間分辨率上的間隙。 12RAW264.7細(xì)胞在37、5CO2條件下，用含10小牛血清、青霉素(1 X10 UL)及鏈霉素(100m L)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。液氮中復(fù)蘇 換液 傳代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期傳板凍存保留細(xì)胞 Figure 3-6. Four types of light microscopy. (A) The image of

6、 a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, a technique known as bright-field microscopy. The other images were obtained by techniques discussed in the text: (B) phase-contrast microscopy, (C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D)

7、 dark-field microscopy. Figure 3-7. The confocal microscope. This diagram shows that the basic arrangement of optical components is similar to that of the standard fluorescence microscope except that a laser is used to illuminate a small pinhole whose image is focused at a single point in the specim

8、en (A). Fluorescence from this focal point in the specimen is focused at a second pinhole (B). Light from elsewhere in the specimen is not focused here and therefore does not contribute to the final image (C). By scanning the beam of light across the specimen, a very sharp two-dimensional image of t

9、he exact plane of focus is built up that is not significantly degraded by light from other regions of the specimen. F. The confocal microscopeGFP can be used to study dynamic processes as they occur in a living cell.（一）電了顯微鏡基本知識(shí) 分辨率最終決定于光的波長(zhǎng)，由于使用電子束作光源，電鏡的分辨率大大提高。電鏡的分辨率常常是超薄切片厚度的1/10，它的分辨率可達(dá)0.2nm，其放

10、大倍數(shù)為106倍。 電鏡的基本構(gòu)造包括：電子束照明系統(tǒng) ；電磁透鏡成像系統(tǒng)；真空系統(tǒng)；記錄系統(tǒng)；電源系統(tǒng)。（P52表3-1）（二）主要電鏡制樣技術(shù)介紹人 樣品制備技術(shù)的特殊要求：樣品要??；更好地保持樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)；樣品具有一定的反差。 18 主要的用于觀察生物樣品的電鏡技術(shù)有：超薄切片技術(shù)；是觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。負(fù)染色技術(shù)；冷凍斷裂和冷凍蝕刻電鏡技術(shù)技術(shù)； 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)；掃描電鏡技術(shù)（SEM）是觀察細(xì)胞表面形的有力工具。三、掃描隧道顯微鏡(STM) 是一種探測(cè)微觀世界物質(zhì)表面形貌的儀器，在納米生物學(xué)的研究領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)越性。 STM的特點(diǎn)：具有原子尺度的高分辨本領(lǐng)；可在真空、大氣、液

11、體等條件下工作；非破壞性測(cè)量。 20Chemical fixationSpecimen Preparation for Electron MicroscopyThin Sectioning for TEMThe wax sections: 3-10um;The Plastic ultrathin-sections for TEM: 40-50nmSections of LM: 5um;Sections of TEM: 100nm Figure 3-9. Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other he

12、avy metal ions. The cell wall, nucleus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are easily seen. Figure 3-10. Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For compar

13、ison, the same structure is shown by differential-interference-contrast light microscopy (B) and by thin-section electron microscopy (C). Figure 3-11. Cells in culture. Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish.Figure 3-13. Preparation of

14、 a metal-shadowed replica of the surface of a specimen. Note that the thickness of the metal reflects the surface contours of the original specimen. Figure 3-14. Freeze-fracture electron micrograph of the thylakoid membranes from the chloroplast of a plant cell. These membranes, which carry out phot

15、osynthesis, are stacked up in multiple layers. The largest particles seen in the membrane are the complete photosystem II-a complex of multiple proteins. IV. Freeze-Fracture and Freeze-Etch Electron Microscopy Figure 3-15. Freeze-etch electron microscopy. The specimen is rapidly frozen, and the bloc

16、k of ice is fractured with a knife (A). The ice level is then lowered by sublimation in a vacuum, exposing structures in the cell that were near the fracture plane (B). Following these steps, a replica of the still frozen surface is prepared, and this is examined in a transmission electron microscop

17、e. Freeze Fracture Replication and Freeze Etchingquick freeze deep etching第二節(jié) 細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞成分分析和形態(tài)學(xué)觀察相結(jié)合，可揭示生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的構(gòu)建及功能。一、用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物 利用多種方法使細(xì)胞崩解，形成細(xì)胞器和細(xì)胞組分的混合勻漿，再通過(guò)差速離心，即利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同離心力，將各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分開。 差速離心與密度離心相結(jié)合可以達(dá)到精確的分離。A. The technique of differential centrifugationStep-by-st

18、ep procedure for the purification of organelles by differential centrifugation.S=(dx/dt)/2x =110-13sec. Figure 3-16. The preparative ultracentrifuge. Figure 3-17. Cell fractionation by centrifugation. Repeated centrifugation at progressively higher speeds will fractionate homogenates of cells into t

19、heir components. In general, the smaller the subcellular component, the greater is the centrifugal force required to sediment it. Typical values for the various centrifugation steps referred to in the figure arelow speed: 1,000 times gravity for 10 minutes medium speed: 20,000 times gravity for 20 m

20、inutes high speed: 80,000 times gravity for 1 hour very high speed: 150,000 times gravity for 3 hours 34Figure 3-18. Comparison of methods of velocity sedimentation and equilibrium sedimentation. 細(xì)胞不同組分沉降率不同，主要依賴于它們的形狀和大小，通常以沉降系數(shù)S來(lái)表示(沉降系數(shù)是指懸浮在密度較低的溶劑中的一種溶質(zhì)大分子，在每單位離 心場(chǎng)作用下的沉降速率)。二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類、脂質(zhì)等到的

21、顯色方法 原位成分分析常利用一些顯色劑與所檢物質(zhì)的特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過(guò)染色反應(yīng)的部位和顏色的深淺來(lái)斷某種物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布與含量。 福爾根(Feulgen)反應(yīng)可特異顯示DNA的存在部位。 PAS反應(yīng)可確定多糖的存在。 四氧化鋨 可證明脂肪滴的存在。蘇 丹 和蘇丹 黑也常用于脂肪的鑒定。 米倫反應(yīng)及重氮反應(yīng)等用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)。 檢測(cè)和定位酶的技術(shù)是基于細(xì)胞或組織切片與適宜底物共同孵育，通過(guò)一定方法使產(chǎn)物顯示出來(lái) 。例如檢測(cè)堿性磷酸酶的格莫瑞方法。三、特異蛋白質(zhì)抗原的定位與定性 免疫熒光和免疫電鏡是最常用的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位技術(shù)。1、免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)就是將免疫學(xué)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)

22、 相結(jié)合研究特異蛋白質(zhì)抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。Figure 3-19. Indirect immunocytochemistry. The method is very sensitive because the primary antibody is itself recognized by many molecules of the secondary antibody. The secondary antibody is covalently coupled to a marker molecule that makes it readily detectable. Commonly u

23、sed marker molecules include fluorescein or rhodamine dyes, the enzyme horseradish peroxidase or colloidal gold spheres, and the enzymes alkaline phosphatase or peroxidase. 2、免疫電鏡技術(shù) 免疫電鏡技術(shù)使特異蛋白的定位與超 微結(jié)構(gòu)結(jié)合起來(lái)，使抗原定位更準(zhǔn)確。如蛋白分泌的研究胞內(nèi)酶 的研究；一些結(jié)構(gòu)蛋白的研究。 四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性1、原位雜交技術(shù) 用標(biāo)記的核酸探針通過(guò)分子雜交確定特殊核苷酸序列在染色體上或細(xì)胞中的

24、位置的方法。2、Southern技術(shù)（了解） 蛋白樣品經(jīng)電泳后，與DNA探針進(jìn)行吸附，與DNA有親合作用的蛋白帶被顯示出來(lái)。 五、利用放射性標(biāo)記技術(shù) 研究生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的合成動(dòng)態(tài) 放射自顯影技術(shù)是利用放射性同位素的電離輻射對(duì)乳膠的感光作用，對(duì)樣品中放射性標(biāo)記物進(jìn)行定性與定位測(cè)定。 放射自顯影技術(shù)包括兩個(gè)主要步驟：即同位素標(biāo)記的大分子前體的摻入和細(xì)胞內(nèi)同位素所在位置的顯示。 基本步驟為：摻入、制片、敷膠、曝光、顯影、鏡檢。 六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)1、顯微分光光度測(cè)定技術(shù) 根據(jù)細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對(duì)光譜吸收的原理，來(lái)測(cè)定這些物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。2、流式細(xì)胞儀 可定量地測(cè)定某一細(xì)

25、胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量，以及細(xì)胞群體中上述成分含量不同的細(xì)胞的數(shù)量。第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)就是將動(dòng)植物組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分散成單個(gè)細(xì)胞 或直接以單細(xì)胞 生物，給予必要的生長(zhǎng)條件，讓其在培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)與增殖。（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 從機(jī)體取出立即培養(yǎng)的細(xì)胞叫原代細(xì)胞。適應(yīng)在培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞為傳代細(xì)胞。 通過(guò)純系化或選 擇法從原代培養(yǎng)細(xì)胞中分離出來(lái)的細(xì)胞群體叫細(xì)胞株，細(xì)胞分裂周期約限于5060次。 43從原代細(xì)胞或細(xì)胞株中獲得的可無(wú)限傳代的細(xì)胞叫細(xì)胞系。（二）植物細(xì)胞培養(yǎng) 單倍體細(xì)胞培養(yǎng)。 原生質(zhì)體培養(yǎng)：去壁的植物細(xì)

26、胞叫原生質(zhì)體?？膳囵B(yǎng)成植株或體細(xì)胞雜交植株。（三）非細(xì)胞體系在細(xì)胞生物學(xué)研究中的作用 來(lái)源于細(xì)胞，而不具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但包含了正常生物學(xué)反應(yīng)所需的物質(zhì)（供能系統(tǒng)和酶反應(yīng)體系等）組成的體系即為非細(xì)胞體系。二、細(xì)胞工程 應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)方法，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)，有計(jì)劃地改變或創(chuàng)造細(xì)胞遺傳物質(zhì)的技術(shù)以及發(fā)展這種技術(shù) 的領(lǐng)域?yàn)榧?xì)胞工程。 細(xì)胞工程所使用的技術(shù)主要是細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞分化的定向誘導(dǎo)、細(xì)胞融合和顯微注射等。（一）細(xì)胞融合與細(xì)胞雜交技術(shù) 真核生物的體細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞融 合成一個(gè)雙核 或多核細(xì)胞的過(guò)程叫細(xì)胞融合。 動(dòng)物細(xì)胞融合一般要用滅活的病毒(如仙臺(tái)病毒)或 化學(xué)物質(zhì)(如聚乙二醇，即P

27、EG）介導(dǎo)；植物細(xì)胞事例時(shí)，要用纖維素酶去掉纖維素壁。 20世紀(jì)80年代又發(fā)明了電融合技術(shù)。 細(xì)胞融合可以在基因型相同的細(xì)胞間進(jìn)行，也可以在基因型不同的種內(nèi)細(xì)胞間甚至種間細(xì)胞間進(jìn)行。（二）單克隆抗體技術(shù) 1975年英國(guó)學(xué)者M(jìn)ilestein等開創(chuàng)了將產(chǎn)生抗體的單 個(gè)細(xì)胞同瘤細(xì)胞雜交的技術(shù)。他們的設(shè)計(jì)是經(jīng)綿羊紅 細(xì)胞免過(guò)的小鼠脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)與骨髓瘤細(xì)胞融合，融合的雜交瘤具有兩種親本細(xì)胞的特性即可分泌抗綿 羊紅細(xì)胞的抗體，又可無(wú)限增殖。學(xué)者們紛紛利用這 一技術(shù)來(lái)制備針對(duì)不同抗原的高度純一的單克隆抗體。 單克隆抗體就是單個(gè)雜交瘤細(xì)胞 增殖產(chǎn)生的克隆細(xì)胞群分泌的高度純一的抗體。（三）細(xì)胞折合與顯

28、微操作技術(shù) 細(xì)胞拆合就是把細(xì)胞核與質(zhì)分離開后將不同來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核相互配合，形成核質(zhì)雜交細(xì)胞。 顯微操作技術(shù)：即在顯微鏡下用顯微操作裝置對(duì)細(xì)胞進(jìn)行解剖和微量注射的技術(shù)。Figure 3-33. The production of hybrid cells. Human cells and mouse cells are fused to produce heterocaryons, which eventually form hybrid cells. These particular hybrid cells are useful for mapping human genes on specific human chromosomes because most of the human chromosomes are quickly lost in a random manner, leaving clones that retain only one or a few. The hybrid cells produced by fusing other types of