21章-基因治療課件

1、基因治療第二十一章10/10/20221基因治療第二十一章10/3/20221第一節(jié) 基因治療的策略和基本程序第二節(jié) 基因治療中的病毒載體第三節(jié) 基因治療的臨床應(yīng)用第四節(jié) 基因治療的現(xiàn)狀10/10/20222第一節(jié) 基因治療的策略和基本程序10/3/20222基因治療（gene therapy） 通過一定方式將人正常或野生型（wild type）基因或有治療作用的DNA片段導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以矯正或置換致病基因的治療方法 10/10/20223基因治療（gene therapy） 通過一定方第一節(jié) 基因治療的策略和基本程序一、基因治療的策略二、基因治療的一般程序三、基因治療中基因?qū)氲姆椒?0/1

2、0/20224第一節(jié) 基因治療的策略和基本程序一、基因治療的策略10/3一、基因治療的策略1. 致病基因的原位置換 用正常的基因置換染色體上的致病基因。但目前基因定向同源重組的技術(shù)還不能達(dá)到理想的效果。 10/10/20225一、基因治療的策略1. 致病基因的原位置換10/3/2022. 基因的異位替代 在體外將正常基因轉(zhuǎn)移到患者的宿主細(xì)胞 ，只要求治療基因能夠替代致病基因在體內(nèi)表達(dá)出功能正常的蛋白質(zhì)。是目前基因治療的主要策略。 3. 直接抑制有害基因的表達(dá) 已知某一疾病基因，可向患者體內(nèi)導(dǎo)入某一抑制該基因的基因或有抑制該基因作用的核酸?；蚪柚锛夹g(shù)（反義RNA、siRNA、核酶等）抑制或封

3、閉該疾病基因的mRNA的功能。 10/10/202262. 基因的異位替代 在體外將正?；蜣D(zhuǎn)移到患者4.增強機體免疫能力的基因治療 將抗體或細(xì)胞因子的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞以激活體內(nèi)免疫細(xì)胞的活力。 10/10/202274.增強機體免疫能力的基因治療 將抗體或細(xì)胞因子二、基因治療的一般程序1.治療基因的選擇 細(xì)胞內(nèi)的基因在理論上均可用于基因治療?？捎嗅槍π缘剡M(jìn)行選擇。 10/10/20228二、基因治療的一般程序1.治療基因的選擇 10/3/2022.將治療性基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi) 基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 基因轉(zhuǎn)移的非病毒方法(物理方法和化學(xué)方法)。 基因轉(zhuǎn)移的病毒方法。 10/10/202292.將治療性基因轉(zhuǎn)

4、入細(xì)胞內(nèi) 基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 10/3/2023.基因治療的靶細(xì)胞 體細(xì)胞 包括：病變組織細(xì)胞 正常的免疫功能細(xì)胞 1） （hematopoietic stem cells） 骨髓中具有高度自我更新能力的、能永久重建造血的細(xì)胞，同時它能進(jìn)一步分化為其他血細(xì)胞，并能保持基因組DNA的穩(wěn)定 造血干細(xì)胞2）肌細(xì)胞胞內(nèi)的溶酶體和DNA酶含量也很低，質(zhì)粒DNA以環(huán)狀形式在胞漿中存在不整合入基因組DNA，能在肌細(xì)胞內(nèi)較長時間保留 10/10/2022103.基因治療的靶細(xì)胞 體細(xì)胞 1） 成功用于基因治療的靶細(xì)胞 靶 細(xì) 胞優(yōu) 點缺 點造血干細(xì)胞自我更新能力和分化能力。最有前途的靶細(xì)胞之一。骨髓中含量低，難以獲

5、得足夠的量皮膚成纖維細(xì)胞來源廣，易擴增培養(yǎng)，易于移植。可以穩(wěn)定表達(dá)一段時間肌細(xì)胞易于吸收，肌細(xì)胞內(nèi)的溶酶體和DNA酶含量很低。適合DNA疫苗治療。10/10/202211成功用于基因治療的靶細(xì)胞 靶 細(xì) 胞優(yōu) 點缺 點造血三、基因治療中基因?qū)氲姆椒?(一)非病毒導(dǎo)入法 直接注射法 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 優(yōu)點 不會整合入靶細(xì)胞的基因組中 缺點 易在靶細(xì)胞中降解10/10/202212三、基因治療中基因?qū)氲姆椒?(一)非病毒導(dǎo)入法10/3/21.直接注射法 將含有裸DNA（質(zhì)粒）的溶液直接注射入肌肉組織 優(yōu)點 可持續(xù)表達(dá)幾個月至一年 缺點 僅限于在肌肉組織 需要注射大量的DNA 轉(zhuǎn)入效率低10/10/

6、2022131.直接注射法 將含有裸DNA（質(zhì)粒）的溶液直接注2.電穿孔法 用高壓脈沖電場在細(xì)胞膜上打孔將DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素 電脈沖強度 持續(xù)時間 10/10/2022142.電穿孔法 用高壓脈沖電場在細(xì)胞膜上打孔將DN3.脂質(zhì)體法(liposome） 脂質(zhì)體與DNA形成復(fù)合物通過內(nèi)吞作用進(jìn) 入細(xì)胞 4.陽離子多聚體 陽離子聚胺與陰離子DNA形成復(fù)合物，與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的受體結(jié)合，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞 10/10/2022153.脂質(zhì)體法(liposome） 脂質(zhì)體與DNA形（二）病毒載體導(dǎo)入法 病毒的特點 靶細(xì)胞定向感染性 宿主細(xì)胞寄生性 野生型病毒改造的原則 保留感

7、染性 去除致病性 10/10/202216（二）病毒載體導(dǎo)入法 病毒的特點10/3/202216第二節(jié) 基因治療中的病毒載體一、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體二、腺病毒載體 三、主要病毒載體的特點比較四、存在的主要缺點10/10/202217第二節(jié) 基因治療中的病毒載體一、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體10/3/一、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（retrovirus） 1.基因組10/10/202218一、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（retrovirus） 1.基因2.特點 來源 莫羅尼氏鼠白血病病毒（MoMuLV)感染范圍 鼠、人和其它動物細(xì)胞感染方式 通過外膜蛋白與靶細(xì)胞表面的磷酸 轉(zhuǎn)運載體結(jié)合而感染進(jìn)入細(xì)胞 10/10/2022192.特點 來

8、源 莫羅尼氏鼠白血病病毒（MoMu專一性 取決于病毒顆粒膜糖蛋白Env和靶細(xì)胞膜表面的受體相互作用。可以將病毒外膜糖蛋白進(jìn)行各種不同的修飾，以改變其專一性。 分類： 單嗜性（ecotropic）病毒： 僅能感染小鼠細(xì)胞 雙嗜性（amphotropic）病毒：能感染小鼠和其 他動物細(xì)胞 兼嗜性（dualtropic）病毒： 能感染多種不同種 屬的動物細(xì)胞。 10/10/202220專一性 取決于病毒顆粒膜糖蛋白Env和靶細(xì)胞膜逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因治療的流程 將治療基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中 篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞 轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng) 從上清中獲得重組病毒顆粒和純化感染靶細(xì)胞。10/10/202221逆轉(zhuǎn)錄病

9、毒載體介導(dǎo)的基因治療的流程 10/3/202221二、腺病毒載體 DNA病毒。根據(jù)其凝血特性分為A-F 6個亞類，其中C亞類的2型和5型腺病毒（Ad 2和Ad 5）在人體內(nèi)基本上不致病，故可作為基因治療用載體。 優(yōu)點 基因轉(zhuǎn)移效率較高 治療基因瞬時水平表達(dá)高 10/10/202222二、腺病毒載體 DNA病毒。根據(jù)其凝血特性分為三、主要病毒載體的特點比較逆轉(zhuǎn)錄病毒(RV)慢病毒(HIV、FIV等)腺病毒(Ad)腺相關(guān)病毒(AAV)單純皰疹病毒(HSV)基因組大小(kb)8119.29.7354.6152核酸類型RNARNADNADNADNA外源基因容量約10kb約10kb78kb約4kb可達(dá)3

10、0kb重組病毒滴度較高較高非常高高相對低靶細(xì)胞狀態(tài)分裂期細(xì)胞，表面須有特殊受體分裂期細(xì)胞及非分裂期細(xì)胞分裂期細(xì)胞及非分裂期細(xì)胞分裂期細(xì)胞及非分裂期細(xì)胞分裂期細(xì)胞及非分裂期細(xì)胞，嗜神經(jīng)性基因整合隨機整合隨機整合不整合定點整合不整合外源基因表達(dá)情況瞬時表達(dá)/穩(wěn)定表達(dá)瞬時表達(dá)/穩(wěn)定表達(dá)瞬時表達(dá)穩(wěn)定表達(dá)瞬時表達(dá)10/10/202223三、主要病毒載體的特點比較逆轉(zhuǎn)錄病毒(RV)慢病毒腺病毒四、存在的主要缺點宿主譜窄基因?qū)胄实屯庠椿虮磉_(dá)不夠長期穩(wěn)定表達(dá)缺乏有效調(diào)控感染的靶向問題毒性問題10/10/202224四、存在的主要缺點宿主譜窄10/3/202224第三節(jié) 基因治療的臨床應(yīng)用一、惡性腫瘤 二

11、、心腦血管性疾病 三、遺傳性疾病四、艾滋病10/10/202225第三節(jié) 基因治療的臨床應(yīng)用一、惡性腫瘤 10/3/2022一、惡性腫瘤1.惡性腫瘤發(fā)病的分子機制 原癌基因和抑癌基因的相互作用失衡腫瘤細(xì)胞逃逸了免疫監(jiān)視細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常10/10/202226一、惡性腫瘤1.惡性腫瘤發(fā)病的分子機制 原癌基因和抑癌基因2.治療策略 1) 抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞 自殺療法抑制癌基因的表達(dá)恢復(fù)抑癌基因的功能抗腫瘤血管生成10/10/2022272.治療策略 1) 抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞 自殺療法抑制癌基因2) 腫瘤細(xì)胞的基因修飾 導(dǎo)入細(xì)胞因子基因?qū)隡HC基因和共刺激分子基因10/10/2022282) 腫瘤

12、細(xì)胞的基因修飾 導(dǎo)入細(xì)胞因子基因?qū)隡HC基因和3) 調(diào)節(jié)和增強機體的免疫功能 細(xì)胞因子基因?qū)朊庖呒?xì)胞 基因修飾的樹突狀細(xì)胞 分泌免疫毒素的T淋巴細(xì)胞 腫瘤DNA疫苗10/10/2022293) 調(diào)節(jié)和增強機體的免疫功能 細(xì)胞因子基因?qū)朊庖呒?xì)二、心腦血管性疾病 1.單基因遺傳病 類型 家族性高膽固醇血癥遺傳性擴張型心肌病肥厚型心肌病長Q-T綜合征遺傳性心肌營養(yǎng)不良10/10/202230二、心腦血管性疾病 1.單基因遺傳病家族性高膽固醇 特點 發(fā)病率低 基因治療的靶基因明確 效果較好10/10/202231 特點 發(fā)病率低10/3/2022312.多基因心血管病 類型 高血壓動脈粥樣硬化心

13、肌肥厚心功能不全發(fā)病率高發(fā)病的分子機制尚不清楚基因治療效果差 特點10/10/2022322.多基因心血管病高血壓發(fā)病率高 特點10/3/20223三、遺傳性疾病腺苷脫氨酶（ADA）缺陷病 病 因 ADA缺陷重癥聯(lián)合免疫缺陷癥 （SCID） 治療靶細(xì)胞 骨髓干細(xì)胞 治療載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒 人類歷史上第一種應(yīng)用基因治療的疾病 10/10/202233三、遺傳性疾病腺苷脫氨酶（ADA）缺陷病10/3/2022-地中海貧血 病 因 -珠蛋白表達(dá)失衡，溶血型貧血。 治療靶細(xì)胞 造血干細(xì)胞。 載 體 陽離子脂質(zhì)體，逆轉(zhuǎn)錄病毒， 腺相關(guān)病毒。 10/10/202234-地中海貧血10/3/202234四、艾

14、滋病（AIDS） 治療策略 反義核酸與核酶（rev, gag, nef） 病毒mRNA二級結(jié)構(gòu)類似物（TAR、RRE 競爭性 結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白Tat、 Rev） 細(xì)胞內(nèi)抗體（gp120抗體） HIV突變蛋白 清除HIV感染細(xì)胞（免疫毒素、IFN-、自殺 基因）。 10/10/202235四、艾滋?。ˋIDS） 治療策略 10/3第四節(jié) 基因治療的現(xiàn)狀一、基因治療臨床試驗研究現(xiàn)狀 二、安全性三、基因治療的前景10/10/202236第四節(jié) 基因治療的現(xiàn)狀一、基因治療臨床試驗研究現(xiàn)狀 1一、基因治療臨床試驗研究現(xiàn)狀 基因治療的范圍 從單基因遺傳病多種臨床疾病 所用基因類型 單基因多基因（14.2%）1

15、0/10/202237一、基因治療臨床試驗研究現(xiàn)狀 基因治療的范圍10/3/20 所用的靶細(xì)胞 多為自體細(xì)胞 少為經(jīng)過修飾的異體細(xì)胞 基因?qū)胂到y(tǒng) 病毒載體系統(tǒng)： 逆轉(zhuǎn)錄病毒居首位，腺病毒次之 非病毒載體系統(tǒng)：脂質(zhì)體居首位 10/10/202238 所用的靶細(xì)胞 10/3/202238基因?qū)胪緩?瘤內(nèi)注射（34.8%） 皮下注射肌肉注射 靜脈注射 其他 治療病種分布 癌癥居首位，感染性疾病次之10/10/202239基因?qū)胪緩?10/3/202239二、基因治療的安全性反轉(zhuǎn)錄病毒載體：有致瘤、致畸的可能性，受到 限制腺病毒載體： 具有更好的安全性，受到重視10/10/202240二、基因治療的安全性反轉(zhuǎn)錄病毒載體：有致瘤、致畸的可能性，基因治療臨床試驗階段 期臨床（51.6%） 期臨床（14.5%） 期臨床（7.2%）基因治療開展最好的國家 美國（占全部基因治療病人的60.4%）10/10/202241基因治療臨床試驗階段 10/3/202241三、基因治療的前景 展望 從實驗室臨床，逐步走向成熟 是一個極有希望和發(fā)展前景的領(lǐng)域 存在的問題 缺乏高效特異的基因?qū)胂到y(tǒng) 缺乏調(diào)控基因表達(dá)的方式 10/10/20