文庫的建立與篩選課件

1、微生物基因工程與代謝工程文庫的建立與篩選李 剛 副教授contentsDNA文庫的構(gòu)建2DNA文庫與cDNA文庫1cDNA文庫的構(gòu)建步驟3 常用的cDNA文庫篩選方法5cDNA文庫的構(gòu)建要點4基因組文庫（DNA文庫）基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體。構(gòu)建基因組文庫時，先將原核或真核細胞染色體DNA提純，通過機械剪切或酶切使之成為一定大小的片段，將其與適當?shù)妮d體（噬菌體或質(zhì)粒）相連接，經(jīng)體外包裝，轉(zhuǎn)染細菌，得到一組含有不同DNA片段的重組噬菌體顆粒（或轉(zhuǎn)化子菌落）。這個文庫中將含有基因組內(nèi)全部基因片段，它象一個貯存有基因全部序列的信息庫，故稱為基因組文庫。含有目的

2、基因片段的重組子，可以通過標記探針與基因組文庫中的重組子雜交等方法篩選出來。cDNA文庫cDNA是指以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補DNA（Complementary DNA，簡稱cDNA）。cDNA文庫是指一群含有目標菌全部cDNA片段的重組DNA的細菌或噬菌體克隆。由于cDNA是由mRNA反轉(zhuǎn)錄而來，因此足夠數(shù)目的克隆總和則包含細胞的全部mRNA的信息。cDNA文庫與DNA文庫的區(qū)別1、cDNA文庫選用的供體不是源于生物體的基因組，而是由細胞的mRNA所轉(zhuǎn)錄出的cDNA。2、cDNA便于克隆和大量擴增，不象基因組DNA含有內(nèi)含子很難表達，可以從cDNA庫中篩選到所需的目的基因

3、，并直接用于該目的基因的表達。所以在基因工程研究中，真核細胞的cDNA文庫往往比基因組文庫更為有用。組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫： 存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。 基因組文庫（DNA文庫）的構(gòu)建限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細菌體外包裝mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制cDNA文庫的構(gòu)建 尿素-氯化鋰法硫氰酸胍法Oligo（dT）親和層析法密度梯度離心分級法探針篩選法（一）mRNA的分離與純化Oligo(dT)親和層析法AAAA

4、AAAAAAAAOligo(dT)Oligo(dT)Oligo(dT)（二）從mRNA制備cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA (三) cDNA片段的連接和轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)化） （四）cDNA文庫的篩選cDNA文庫的分類cDNA文庫可根據(jù)克隆cDNA片段的載體能否表達分為表達型和非表達型兩類，也可根據(jù)載體的不同，分為質(zhì)粒cDNA文庫和噬菌體cDNA文庫。表達型文庫插入的片段可表達產(chǎn)生融合蛋白，具有抗原性或生物活性。這類cDNA庫適用于那些蛋白質(zhì)的氨基酸序列目前尚不清楚，不能采用核苷酸探針篩選的目的基因，可采用能與表達產(chǎn)物發(fā)生特異性結(jié)合的抗體或化合物進行標記篩選

5、。最常用的表達型文庫是gt11 cDNA庫。非表達型文庫插入片段DNA序列（或部分序列）已經(jīng)清楚，或其表達產(chǎn)物的部分氨基酸序列已經(jīng)清楚，可采用核苷酸探針進行篩選。核苷酸探針可以是從部分蛋白質(zhì)序列中推知的人工合成的寡核苷酸序列，也可以使同種或同屬的已知的同源序列。這類cDNA庫中最常用的是gt10 cDNA文庫。質(zhì)粒cDNA庫以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的cDNA文庫。包含的cDNA克隆數(shù)目較少，適于較高豐度的mRNA。噬菌體cDNA庫以噬菌體為載體構(gòu)建的cDNA文庫。包含的cDNA克隆數(shù)目非常多，適用于那些低豐度和極低豐度的mRNA。構(gòu)建cDNA文庫前需要考慮的問題1、篩選方法。若采用核苷酸探針進行篩選，

6、可構(gòu)建表達型或非表達型cDNA庫；如利用蛋白質(zhì)的生物活性或免疫原性進行篩選，則只能構(gòu)建表達型cDNA庫。2、目的mRNA的豐度。高豐度的目的mRNA所需構(gòu)建的cDNA庫相對較??；而極低豐度的目的mRNA，如僅占mRNA總量的1/106的某些mRNA，所需構(gòu)建的cDNA庫必須很大，以盡可能包括其對應(yīng)的克隆。理想的cDNA文庫的特征1、包含有足夠大量的獨立克隆代表最初的 mRNA樣品中的所有轉(zhuǎn)錄體（即庫容量 大、多樣性好）。2、克隆中包含接近全長的mRNA。構(gòu)建cDNA文庫的步驟說明1、總RNA的提取及mRNA的分離；2、cDNA第一鏈的合成；3、cDNA第二鏈的合成；4、cDNA與載體的連接；5

7、、噬菌體的包裝及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化?？俁NA的提取及mRNA的分離成功地構(gòu)建一個cDNA文庫，mRNA的獲得及其質(zhì)量是一個至關(guān)重要的因素。各類材料的總RNA提取，采用 Trizol Reagent（Qiagen），具體步驟詳見下一張幻燈片。從總RNA中回收mRNA，建議采用Oligotex mRNA Mini Kit（Qiagen），具體步驟參見產(chǎn)品說明書。 TRIZOL 法提取真菌（植物）RNA操作程序（Invitrogen 公司 protocol）一、 所需試劑：氯仿，異丙醇，75%乙醇（用DEPC水配制），DEPC水。二、 操作程序：1、500mg離心收集的濕菌絲體，加1ml TRIZOL

8、,勻漿器中勻漿5分鐘（液氮研磨成粉后再加入TRIZOL可獲得更佳的效果 ），至菌絲體完全搗碎。2、4、12000g離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清。3、上清室溫放置5分鐘，加0.2ml氯仿，用手劇震15秒，室溫放置2-3分鐘。4、4、11000g離心15分鐘，轉(zhuǎn)移水相。5、水相中加入0.25ml異丙醇及0.25ml高鹽沉淀液（0.8M檸檬酸鈉，1.2MNaCl）混勻，室溫放置10分鐘。6、4、11000g離心10分鐘去上清。7、加1ml 75%乙醇，vortex混勻，4、7000g離心5分鐘，去上清。8、沉淀在空氣中干燥5-10分鐘，用100l DEPC水溶解，槍頭吸打幾次，放于55水浴中10分鐘促溶。

9、9、電泳及測OD值，檢定RNA的量及完整性。10、RNA放-70 保存。cDNA第一鏈的合成和cDNA第二鏈的合成實驗原理即RT-PCR，此處略。推薦采用專門建cDNA文庫的試劑盒進行。這類的試劑盒有很多，可參見后面的建庫試劑盒推薦。cDNA與載體的連接如果采用試劑盒建庫，相關(guān)參數(shù)可參考試劑盒說明書。如果不是用試劑盒建庫，則可參考下面的連接要點：如果是噬菌體文庫的連接，建議連接反應(yīng)在高濃度的DNA條件下進行（200 ng/L）。插入DNA片段最好進行CIAP去磷酸化處理，以防止自連。另外連接反應(yīng)中應(yīng)采用理想的載體臂：插入片段的質(zhì)量比為2：1（2g載體臂DNA和1 g 插入片段DNA）。不過也可

10、以進行一系列不同載體臂：插入片段的試驗。如果是質(zhì)粒文庫的連接，連接成功的關(guān)鍵是插入片段最好進行去磷酸化處理，并且保證插入片段和載體的摩爾比為3：1。噬菌體的包裝及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化如果采用質(zhì)粒DNA作為載體，cDNA與載體連接后可直接轉(zhuǎn)化宿主細胞，建立cDNA文庫。如采用噬菌體作為載體，必須經(jīng)過體外包裝，形成噬菌體顆粒，感染宿主菌。包裝蛋白來自大腸桿菌的抽提液。文庫的包裝應(yīng)使用廠家提供的包裝提取物，如Gigapack Gold Packaging Extract（Stratagene），并按說明操作。包裝后必須測定噬菌體的效價，只有達到一定的效價，才能大規(guī)模地進行包裝、轉(zhuǎn)染，一旦cDNA文庫建立

11、，應(yīng)進行效價測定并擴增。擴增后的cDNA庫可長期保存，并多次篩選。包裝后的重組噬菌體在感染宿主菌時，其滴度（效價）一般要在106pfu以上，才能保證基因組文庫的完整性和代表性。即一個完整的cDNA庫至少應(yīng)含有1106個克隆，這樣才能保證其中含有每一個單拷貝的mRNA。應(yīng)用噬菌體構(gòu)建基因組文庫的基本步驟1、準備載體DNA：如容量為20-24kb的噬菌體取 代型載體，用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶（如 BamHI）消化，分離得到 DNA的左右兩臂。2、提取高分子量細胞DNA，并選擇合適的限制性 內(nèi)切酶（如Sauce3AI或Mbo）進行部分酶 切。 、分離大小合適的DNA片段：應(yīng)用凝膠電泳法或 密度梯度離心法

12、分離長度在20-24kb之間的片 段，這一步可以顯著減少在每個噬菌體載 體中克隆兩個以上的基因組DNA片段。應(yīng)用噬菌體構(gòu)建基因組文庫的基本步驟4、載體DNA與外源DNA連接。5、連接產(chǎn)物在體外進行包裝。6、檢測重組噬菌體的滴度，分裝保存。7、基因組文庫的擴增或用于篩選所需要的 基因。cDNA文庫構(gòu)建要點（一）構(gòu)建全長cDNA文庫分為噬菌體文庫和質(zhì)粒文庫，二者大同小異。無論怎樣，應(yīng)當注意如下幾個方面：一、保證獲得數(shù)量足夠的高質(zhì)量的起始RNA，一般至少要1 g材料。構(gòu)建cDNA文庫要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允許的情況下一般的試劑盒均推薦采用純化總mRNA后

13、進行反轉(zhuǎn)錄，這比直接采用總RNA進行反轉(zhuǎn)錄而構(gòu)建的cDNA文庫好，雖然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中級柱子要求純化后的總mRNA量最好在0.5-5微克左右，這就要求起始總RNA量較多。雖然有的試劑盒聲稱少至幾十個納克的總RNA也可以構(gòu)建cDNA文庫，但這是針對材料極為稀缺者而言，但起始RNA太少還是會或多或少影響文庫構(gòu)建成功的風險和文庫的代表性。至于RNA的質(zhì)量，如果采用純化總mRNA后反轉(zhuǎn)錄，則對總RNA的雜質(zhì)方面要求稍松，但對RNA的完整性則一絲不茍，要求未降解。如果直接采用總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，則對總RNA的質(zhì)量要求非常高，不僅要求RNA相當完整而無降解，而

14、且要求多酚、多糖、蛋白、鹽、異硫氰酸胍等雜質(zhì)少，最好是試劑盒抽提的。cDNA文庫構(gòu)建要點（二）二、反轉(zhuǎn)錄成功與否及反轉(zhuǎn)錄效率是關(guān)鍵中的關(guān)鍵。這是構(gòu)建cDNA文庫中最貴的一步，也是核酸質(zhì)變的一步，它將易降解的RNA變成了不易降解的cDNA。反轉(zhuǎn)錄不成功，說明一次文庫方案的夭折。反轉(zhuǎn)錄效率不高表現(xiàn)在一是部分mRNA被反轉(zhuǎn)錄了，但還有相當一部分本該反轉(zhuǎn)錄的mRNA未被反轉(zhuǎn)；二是只有少部分mRNA被反轉(zhuǎn)錄通了即達到帽子結(jié)構(gòu)最近處，而很大一部分mRNA沒有反轉(zhuǎn)錄完全，總的全長cDNA太少，這就難以構(gòu)建好的全長cDNA文庫。少量程度的mRNA降解或反轉(zhuǎn)錄不完全在SMART 4等試劑盒及手工方法構(gòu)建中對文庫

15、的滴度影響不大，但對文庫的全長性則有很大影響。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接頭連接后再反轉(zhuǎn)錄的新技術(shù)（可參考其GeneRacer說明書）從原理上是保證最終獲得全長cDNA的最好方法，但對mRNA的完整性要求非常高，理論上講必須是帶有帽子結(jié)構(gòu)和Poly A結(jié)構(gòu)的全長mRNA且反轉(zhuǎn)錄完全，才能進入文庫中。反轉(zhuǎn)錄完成后點樣檢測cDNA的濃度及分子量分布是很重要的。cDNA文庫構(gòu)建要點（三）三、反轉(zhuǎn)錄后至包裝到噬菌體外殼蛋白之前的諸多步驟的操作相對容易，但其中的層析柱cDNA分級很關(guān)鍵。這一步稍不注意會影響成功性或影響獲得的cDNA的片段分布特點。這一步的操作要小心，尤其要在加入

16、cDNA之前通過反復(fù)懸浮和試滴保證柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。獲得的每一級的cDNA量很少，檢測時帶型很暗，所以要用新鮮做的透明薄膠檢測，根據(jù)檢測結(jié)果一定要舍棄太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因為短片段太多會嚴重影響后面的連接轉(zhuǎn)化效果及文庫質(zhì)量）。cDNA文庫構(gòu)建要點（四）四、噬菌體文庫或質(zhì)粒文庫均對載體與cDNA的連接效率要求很高，也對連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率要求很高。連接效率高低直接關(guān)系到文庫構(gòu)建是否成功，更要注意的是文庫連接與一般的片段克隆的連接不一樣。一般的片段克隆連接是固定長度的載體與固定長度的目的DNA連接，而文庫連接是固定長度的載體與非固定

17、長度的目的DNA連接，目的基因cDNA長的有10kb以上，短的只有500bp或更短。一系列長度不等的cDNA與載體在一起連接的結(jié)果，不同長度cDNA的連接效率就不一樣。有的專家的經(jīng)驗是，根據(jù)分級結(jié)果，有意識地將長度不同的cDNA群分別與載體連接，再分別轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染大腸桿菌，分別完成滴度檢測，最后將不同長度級別的文庫混合在一起供雜交篩選。cDNA文庫構(gòu)建試劑盒推薦Stratagene、Novagen、Clonetech、Invitrogen等公司生產(chǎn)的cDNA文庫構(gòu)建試劑盒都非常好用。有了這些商品化的試劑盒后，cDNA文庫能否構(gòu)建成功幾乎就完全依賴于能否獲得高質(zhì)量的mRNA了。幾種cDNA文庫構(gòu)建

18、試劑盒優(yōu)缺點比較Stratagene:優(yōu)點：1. 放射性同位素可跟蹤實驗進程。 2. 有包裝蛋白。缺點：1. 放射性的東西對人體有一定危害。2 載體連接時要加接頭,還要磷酸化。幾種cDNA文庫構(gòu)建試劑盒優(yōu)缺點比較Invitrogen:采用的是Gateway技術(shù)：利用噬菌體位點特異重組系統(tǒng)的BP和LR雙向反應(yīng)，首先將PCR產(chǎn)物用傳統(tǒng)方法連接到Gateway化的入門載體，這個目標基因就可以迅速方便而且定向地重組到任何Gateway化的表達載體上。優(yōu)點:1.無需限制酶切、無需連接，只要利用重組酶就可以穿梭于任何 Gateway化的表達載體間，典型的效率高達95以上，保證正確的方向和閱讀框。2.特別適

19、合研究一個基因在不同表達系統(tǒng)中的表達,對于后續(xù)的工作有利。缺點:1.無論是Gateway還是Topo，封閉的系統(tǒng)僅適用于Invitrogen提供的表達載體，使得使用成本高。而且在啟動子和目的基因間必需插入一段特定的噬菌體重組酶識別序列，對表達的影響不好估計。2.所得的并非都是全長cDNA。幾種cDNA文庫構(gòu)建試劑盒優(yōu)缺點比較Clontech:采用的是SMART與Infusion技術(shù)：合成引物時兩端對應(yīng)加入任意一種線性化載體兩端15個堿基，PCR擴增目標基因后就可以利用重組酶直接將目標基因定向重組到任意指定表達載體上的指定位點。 優(yōu)點：1.采用SMART技術(shù),可以方便的得到全長cDNA。2.開放

20、的技術(shù)平臺，任何質(zhì)粒、任何目的基因都能適用。3.使得PCR產(chǎn)物徹底擺脫了中間載體、重復(fù)亞重復(fù)篩選的煩惱，一步到位，不受載體和酶切位點的限制，不用連接、補平、磷酸化，也不受PCR產(chǎn)物末端影響，而且速度快（30min），重組效率高達90%。4.在載體啟動子和目的基因之間不會增加額外的堿基，真正精確定向克隆。5.Infusion以凍干形式提供，可以在室溫下保存和運輸，不必擔心運輸過程中的溫度問題。 缺點：1.不適用于一對多的克隆，目的基因無法在不同載體間穿梭。針對每個載體均要合成特定的引物進行PCR。2.第二鏈的合成有PCR技術(shù),可能會引起堿基突變。幾種cDNA文庫構(gòu)建試劑盒優(yōu)缺點比較Novagen

21、：優(yōu)點：1.提供兩種primer，oligo dT & random primer，可根據(jù)目的進行選擇；2.提供EcoR/Hind酶切位點，便于定向克?。蝗秉c:不知什么原因第二鏈合成效率不高?；蚪M文庫的保存噬菌體文庫的保存比較簡單，經(jīng)過測試連接反應(yīng)和包裝反應(yīng)條件，選擇合適的條件進行大量連接及包裝，離心除去沉淀，上清中加入少量（幾滴）氯仿，4可長期保存。如果是質(zhì)粒文庫，可將平板上的各個單菌落接種到編號的、含有培養(yǎng)基及篩選因子（如抗生素）的微孔板上，過夜培養(yǎng)，待單菌落長好后，往各孔中分別加入適量的無菌甘油（最終甘油的含量為15-25%），將微孔板封好，放-70保存。 需要自己構(gòu)建cDNA文庫嗎?

22、 近幾年，商業(yè)來源的成品cDNA文庫的數(shù)量和質(zhì)量都得到了極大的提高。另外，用戶還經(jīng)常能以合理的價格訂購到按自己設(shè)想構(gòu)建的文庫。因此，現(xiàn)在國外很少有研究機構(gòu)需要自己構(gòu)建所需的cDNA文庫。構(gòu)建cDNA文庫是一個冗長的過程，需要許多特殊的酶和試劑，而且其中大多數(shù)需要檢測和優(yōu)化。因此，希望自己構(gòu)建文庫的工作者必須考慮商品化試劑盒的如下優(yōu)點：酶、緩沖液、試劑以及許多試劑盒同時提供載體和宿主細胞；方案的每一步驟都經(jīng)過優(yōu)化，而這在學術(shù)實驗室中往往需要消耗研究者數(shù)周的工作；試劑盒中通常提供作為對照的mRNA和cDNA；一些cDNA克隆方法的改進有時只以試劑盒形式提供；最后，盡管試劑盒很昂貴，但按傳統(tǒng)方法自己

23、制備cDNA的實際花費可能更高。 結(jié)論：如果有商品化的cDNA文庫出售，盡量購買（上策）；如果沒有，可以委托一些專業(yè)的技術(shù)服務(wù)公司代為構(gòu)建（中策）；實在不行，再自己構(gòu)建（下策）。cDNA文庫的構(gòu)建及篩選策略關(guān)于目的蛋白已有資料和（或）試劑推薦的文庫構(gòu)建方法推薦的載體推薦的篩選方法編碼同源蛋白cDNA的核酸序列GublerHoffman法（Gubler and Hoffman 1983; Gubler 1988）任何標準質(zhì)粒、噬菌?；蚴删w載體與合成的寡核苷酸或與DNA片段雜交蛋白質(zhì)序列中至少15個連續(xù)氨基酸序列已知GublerHoffman法（Gubler and Hoffman 1983;

24、Gubler 1988）任何標準質(zhì)粒、噬菌?；蚴删w載體用根據(jù)推測合成的寡核苷酸或MOPAC探針雜交蛋白質(zhì)序列中15個連續(xù)氨基酸序列GublerHoffman法（Gubler and Hoffman 1983; Gubler 1988）任何標準質(zhì)粒、噬菌?；蚴删w載體用合成的寡核苷酸雜交抗目的蛋白抗體用Gubler-Hoffman法的引物接頭改良法進行直接克隆任何標準質(zhì)粒、噬菌?；蚴删w載體抗體抗原識別和形成抗原抗體復(fù)合體靶蛋白表達的分析用GublerHoffman法的引物接頭改良法進行直接克??；或質(zhì)粒引發(fā)合成cDNA第一鏈適合進行特定檢測實驗的表達載體；對克隆群進行生物學活性檢測 目的cDN

25、A克隆的鑒定（篩庫）常用的四種篩選方法：常規(guī)核酸雜交；用PCR方法鑒定文庫中含有目的核酸序列的克隆群；通過特異性配體（如抗體或DNA）結(jié)合重組cDNA克隆表達的蛋白；產(chǎn)生的生物活性分子的檢測；篩庫的技巧把所有克隆分成若干個組，每個組含有一定個數(shù)的克?。ɡ?00個或96個），并把所有克隆混合在一起作為該組的代表。篩庫時先篩不同的組，如果在某個組中發(fā)現(xiàn)有探針反應(yīng)或顏色反應(yīng)或抗原抗體反應(yīng)等，則推測目的基因在該組中。把該組的所有成員（例如96個）點在一個96孔板上再進一步篩選，即可找到目的基因。 一、核酸雜交篩庫法（1）這是從cDNA文庫中篩選目的克隆的最常用和最可靠的方法。可以分析數(shù)目極大的克隆，

26、而且既不要求它們是全長cDNA克隆，也不要求宿主細胞合成具有抗原表位或生物活性的產(chǎn)物。同源探針：同源探針至少與目的cDNA克隆的部分核酸序列相同。例如，用現(xiàn)有的只有部分cDNA的克隆從cDNA文庫中分離全長克隆。部分同源探針：部分同源探針用來檢測與探針序列相關(guān)但不盡相同的cDNA克隆，例如從其他種族中克隆同種基因或從同一種族中克隆相關(guān)基因?？俢DNA探針：總cDNA探針是以mRNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄酶在體外均勻摻入放射性標記核苷酸，或者對總的或經(jīng)分級分離的poly (A )+mRNA進行末端標記而制備。如果與目的cDNA克隆相對應(yīng)mRNA在起始群體中的出現(xiàn)頻率至少為1200，則可用總cDNA探

27、針來篩選cDNA文庫。但對于mRNA制品中目的組分含量稀少，用總cDNA探針不可能檢測到同源cDNA克隆。一、核酸雜交篩庫法（2）cDNA扣除探針：cDNA扣除探針經(jīng)常用于探測cDNA文庫中mRNA表達調(diào)控有差異的相應(yīng)克隆。從一種類型的mRNA制備的cDNA探針可通過扣除雜交而耗盡存在于第二種類型mRNA中的相應(yīng)序列。用含目的物的組織抽提的mRNA所制備的單鏈cDNA與來自不表達目的基因的組織中所抽提的1020倍過量的DNA或RNA雜交，達到去處非需序列的目的。將含有cDNA的雜合體除去后，余下的cDNA分子可作為cDNA文庫中，篩選含有同源序列克隆的探針。使用這種扣除的cDNA探針，只要在扣除階段至少除去95的最初標記的cDNA探針，就可能檢測到只占總RNA0.0