2藥物毒理學(xué)-急性毒性和局部毒性yao

1、急性毒性和局部毒性 Acute Toxicity and Local Toxicity 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部 毒理學(xué)系 姚碧云 Tel: 82801531 email: 藥物治病毒性藥理學(xué)(Pharmacology)藥物毒理學(xué) (Drug Toxicology)合理安全用藥藥物研發(fā)全過程CELO：先導(dǎo)化合物優(yōu)化CE：候選藥物評價CS：候選藥物選擇FHD：首次用于人PD：產(chǎn)品決策靶標確認發(fā)現(xiàn)階段非臨床階段臨床階段期 期 期投放市場 期從藥物發(fā)現(xiàn)到投放市場均要進行藥物毒理研究615年CSFHDPDsubmissionLO 急性毒性通常為毒理學(xué)研究的最初步的資料包括經(jīng)口、吸入、經(jīng)皮和其它途徑的急性毒性，研

2、究急性毒效應(yīng)表現(xiàn)、劑量-反應(yīng)關(guān)系、靶器官和可逆性。第一節(jié)急性毒性和急性毒性試驗Acute Toxicity and Acute Toxicity Test 急性毒性(Acute Toxicity)/單次給藥毒性（Single dose Toxicity）: 實驗動物一次 或24小時內(nèi)多次接受某一藥物所 引起的毒性效應(yīng)，甚至死亡。一、概念： 實驗動物接受藥物的方式或途徑不同“一次”的含義也有所不同 經(jīng)口和注射途徑，“一次”是指在瞬間給與試驗動物染毒。 經(jīng)呼吸道吸入與經(jīng)皮膚給藥，“一次” 是指在一個規(guī)定的期間內(nèi)實驗動物持續(xù)地接觸受試化學(xué)物的過程 “多次”的含義是指當(dāng)藥物毒性很低時，即使一次給予實驗

3、動物最大染毒容量還觀察不到毒性作用，便需要在24小時內(nèi)多次染毒，以達到規(guī)定的限制劑量。 急性毒性試驗 (Acute toxicity test) 急性毒性試驗可以分為兩類： 以死亡為終點：以檢測受試物急性毒性上限指標, 主要是求得半數(shù)致死劑量或濃度LD50/LC50 或近似 LD50。 非致死性急性毒性為終點：檢測非致死性指標,可 得到急性毒性 LOAEL和 NOAEL。 LD50：引起實驗動物死亡一半時的劑量。 LOAEL( Lowest Observed Adverse Effect Level) 觀察到有害作用的最低水平水平，在規(guī)定的暴露條件 下，通過試驗和觀察，受試物引起機體形態(tài)、功能

4、、 生長、發(fā)育或者壽命某種有害改變的最低劑量或者濃度。 NOANEL ( No Observed Adverse Effect Level) ： 未觀察到有害作用水平，在規(guī)定的暴露條件下，通過試驗和觀察，受試物未引起機體形態(tài)、功能、生長、發(fā)育或者壽命某種有害改變的最低劑量或者濃度。三、經(jīng)典急性致死性毒性試驗要點 （一）實驗動物的選擇和處置 （二）試驗設(shè)計 （三）毒性癥狀觀察 （四）病理檢查 （五）LD50的計算 （六）意義和局限性選擇對受試物的代謝和毒效應(yīng)表現(xiàn)與人的反應(yīng)盡 可能一致的試驗動物。動物易于獲得品系純化價格較低和易于飼養(yǎng)等條件。 （一）實驗動物的選擇和處置：經(jīng)典急性致死性毒性試驗原則

5、：經(jīng)典急性致死性毒性試驗 體重范圍是；大鼠180240g，小鼠1825g，狗1015kg，試驗 動物體重變異不應(yīng)超過平均體重的20.物種和品系：年齡、體重： 一般常用大、小鼠和狗進行急性毒性實驗，首選大、 小鼠； 用大、小鼠進行致死性毒性測LD50；利用狗觀察毒性反應(yīng)。 通常雌雄各半。性別:（一）實驗動物的選擇和處置： 總的原則是應(yīng)盡可能模擬人可能的給藥途徑，灌胃給藥應(yīng)注意禁食，灌胃后繼續(xù)禁食 24小時。經(jīng)典急性致死性毒性試驗動物檢疫：染毒途徑： 通常情況下觀察57天動物分組： 根據(jù)實驗設(shè)計隨機分組, 至少設(shè) 3個劑量組, 一般設(shè)57個劑量 組，每組810只動物 了解受試藥物的理化特性：化學(xué)結(jié)

6、構(gòu)、分子量，溶解度、 生產(chǎn)批號、純度、雜質(zhì)成分與含量等 根據(jù)受試藥物的試驗規(guī)范要求，決定試驗設(shè)計和 LD50 計算方法。 劑量的設(shè)計: 查閱化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)類似藥物的毒性資料作為參考 總的原則：用少量動物，以較大的劑量間隔進行預(yù)實 驗，獲得1090%的致死劑量范圍，然后在這個劑量 范圍內(nèi)以合適的間距設(shè)幾個（至 少3個）劑量組。（二）實驗設(shè)計：經(jīng)典急性致死性毒性試驗 詳細觀察和記錄實驗動物的中毒體征、 發(fā)生時間、體征發(fā)展的過程、 死亡前特征等。有助于了解該受試物的靶器官并可能為中毒機制提供線索。 實驗動物的體重變化：給藥前、后和死亡時測體重.非致死性指標的可逆性。（三）觀察：經(jīng)典急性致死性毒性試驗

7、給藥后一般要求觀察14天嚙齒類急性毒性試驗中常見的體征和觀察給藥后，動物往往出現(xiàn)興奮抑制死亡，或者抑制死亡的現(xiàn)象。 系統(tǒng)和器官中毒后常見的表現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)與神經(jīng)肌肉系統(tǒng) 體位異常，叫聲異常，活動增多和呆臥少動肌 顫，痙攣，抽搐，麻痹后肢無力，運動失調(diào)，管狀尾，對外界刺激反應(yīng)過敏或遲鈍植物神經(jīng)系統(tǒng) 瞳孔擴大，流涎，流淚，出汗呼吸系統(tǒng) 鼻孔溢液鼻翼扇動，呼吸深緩，呼吸過速，張口 或腹式呼吸泌尿生殖系統(tǒng) 會陰部污穢，有分泌物，陰戶或乳腺腫脹。陰莖突 出遺精皮膚和背毛 皮膚充血，紫紺，背毛蓬松，污穢眼 睛 眼球突出，充血，角膜混濁，血性分泌物經(jīng)典急性致死性毒性試驗 （四）病理學(xué)檢查死亡動物應(yīng)及時進行大

8、體解剖及病理檢查。試驗結(jié)束時，將存活動物處死，亦應(yīng)進行大體解剖。大體解剖發(fā)現(xiàn)病變的組織器官應(yīng)作病理檢查。經(jīng)典急性致死性毒性試驗（五）LD50（LC50）的計算原理： 急性毒性的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線模式圖 求出回歸方程:Y=a+bX。 X為劑量對數(shù)值，Y為死亡率 的概率單位。利用此式即可 求出受試化學(xué)物的LD50及其 95%可信區(qū)間。 受試物A、B、C劑量反 應(yīng)關(guān)系曲線的斜率相 同，而LD50 ABC，因 此，急性毒性大小的次 序為：CBA。 化學(xué)物D的LD50與C相同。 但斜率比C大，可見在 低于LD50的劑量時急性 毒性CD。 4種不同受試物的LD50及劑量/反應(yīng) (死亡) 關(guān)系曲線 利用LD

9、50比較不同受試物的急性毒性 LD50是經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算而得到的毒性參數(shù)，并報告其95%可信限，較少受實驗動物個體易感性差異的影響，因而是最重要的急性毒性參數(shù)。經(jīng)典急性致死性毒性試驗（六）LD50的意義 標準化藥物毒作用強度，評價藥物對機體毒性的大小，比較不同藥物毒性的大小。 計算藥物的治療指數(shù)，藥效學(xué)劑量和毒性劑量的距離。 為后續(xù)的重復(fù)給藥毒理試驗劑量選擇提供參考。 通過比較不同途徑的LD50值，獲得生物利用度的信息。 試驗結(jié)果可用來推測人類的致死劑量以及中毒后的體 征，為臨床毒副反應(yīng)監(jiān)測提供參考。 LD50值給予的有效信息少，作用有限。LD50值不能等同于急性毒性，死亡僅僅是評價急性毒性的許多

10、觀察終點之一。受試物單次大劑量急性中毒，動物多死于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管功能障礙，并不能很好地顯示出各自的毒作用特征和靶器官的 病變。（六）急性毒性試驗存在的局限性 LD50的波動性很大, LD50沒有穩(wěn)定的數(shù)值。EU的80個實驗室測定5種化學(xué)物的LD50，差別可達2.448.38倍化合物范圍（mg/ kg）比值（最大值/最小值）五氯酚74620*8.38水楊酸鈉93023282.50苯胺47911692.44乙酰苯胺72330604.23氯化鎘1054824.59經(jīng)典急性致死性毒性試驗 急性毒性試驗所用的劑量與臨床人用劑量差別很大。不能期望使用急性毒性試驗的結(jié)果來擬定人的臨床劑量。 物種差異對

11、LD50 的影響大。人和動物對藥物的敏感性差別很大，如人和小鼠的致死劑量相差很大。16種化學(xué)藥品的人致死劑量小于小鼠LD50值的110 。 消耗的動物數(shù)量大。經(jīng)典法一次需30-70只動物急性毒性試驗存在的局限性 ICH（人用 藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會）LD50的結(jié)論在北美、歐洲和日本，“經(jīng)典”的LD50測定已不再是單劑量毒性試驗的正式要求。申報資料要求建議進行逐漸增加劑量的耐受性研究，以監(jiān)測不同劑量下的毒性反應(yīng)。建議采用兩種哺乳動物?？梢杂脙煞N嚙齒類動物或一種嚙齒類動物加一種非嚙齒類動物的嚴格設(shè)計的、單次給藥的、逐漸增加劑量的耐受性研究，取代嚙齒類動物或非嚙齒類動物L(fēng)D50測定的要求。如果相

12、關(guān)的話，ICH建議應(yīng)用藥理學(xué)上相關(guān)的主要代謝產(chǎn)物應(yīng)進行單次給藥的毒性研究。ICH規(guī)定在新藥的報批材料中，不必準確的測定LD50，只需了解其近似致死量和詳細觀察記錄中毒表現(xiàn)即可。 第二節(jié)急性毒性替代試驗Alternative Methods for Acute Toxicity 一、固定劑量法（fixed dose procedure） 二、上、下移動法（up/down method） 三、 限量試驗（limit test） 固定劑量法（fixed dose procedure）OECD， 1992，2001。不以動物死亡作為觀察終點劑量（mg/kg）試驗結(jié)果（10只動物，大鼠，雌雄各半）存活數(shù)

13、100%100%存活，毒性表現(xiàn)明顯100%存活，無明顯中毒表現(xiàn)5.0高毒，LD5025mg/kg有毒用50 mg/kg試驗50.0有毒或高毒用5 mg/kg試驗有害LD50200-2000mg/kg用500 mg/kg試驗500.0有毒或有害用50 mg/kg試驗LD502000mg/kg用2000 mg/kg試驗2000.0用500 mg/kg試驗該化學(xué)物無嚴重急性中毒的危險性上、下移動法（up/down method） OECD， 1998，2001。以死亡為終點動物：大鼠， 69只劑量：根據(jù)最初的資料確定第1只動物的染毒劑 量，由第1 只動物染毒后的反應(yīng)決定第2個 動物的染毒劑量，每次間

14、隔24h 的順序給 每只動物染毒一次，觀察：14天上-下法（up/down method）限量試驗（Limit test） 動物：大鼠或小鼠10 20只，雌雄各半。劑量：單次染毒劑量5g/kg體重（食品毒理學(xué)，15g/kg體重）結(jié)論： 無死亡， 最小致死劑量MLD該限量 死亡動物數(shù) 50%，LD50 限量 死亡動物數(shù)50%，重新設(shè)計，進行常規(guī)的急性毒性試驗局部毒性為受試物對機體接觸部位的毒效應(yīng)，不包括經(jīng)接觸部位的吸收而引起的系統(tǒng)毒性。局部毒作用的研究可以是受試物劑量與局部毒作用的劑量-反應(yīng)研究，但對于產(chǎn)品的安全性評價，經(jīng)常是固定劑量以研究時間-效應(yīng)關(guān)系。 局部毒性又稱耐受性試驗第三節(jié)局部毒性試

15、驗Local Toxicity Test皮膚原發(fā)性刺激試驗（skin primary irritation test）包括單次和多次皮膚刺激試驗，完整皮膚和破損皮膚刺激試驗等。觀察終點為皮膚刺激和皮膚腐蝕。 皮膚刺激（dermal irritation）是指其皮膚接觸化學(xué)物后產(chǎn)生的局部可逆性的炎癥變化。皮膚腐蝕（dermal corrosion）是指其皮膚接觸化學(xué)物后產(chǎn)生的局部不可逆性組織損傷一、皮膚原發(fā)性刺激試驗方法：脫毛：試驗前24小時，機械或化學(xué)法脫毛，不可損傷表皮，去毛范圍各約3cm3cm。染毒：取受試物0.5ml (或0.5g) 直接涂在皮膚上，然后用紗布及玻璃紙覆蓋，再用無刺激性膠

16、布和繃帶加以固定，敷用時間為小時試驗結(jié)束后，用溫水或無刺激性溶劑除去殘留受試物，在一只家兔或豚鼠背部脊柱兩側(cè)可各準備3個去毛區(qū)，可進行劑量-反應(yīng)研究，或測試多種受試物。觀察：涂抹部位于染毒后1、24、48小時 觀察皮膚反應(yīng)。皮膚反應(yīng)：紅斑，水腫。 按其嚴重程度評分。Draize試驗動物：健康、皮膚無損傷的白色家兔、豚鼠。至少4只皮膚原發(fā)性刺激試驗 反應(yīng) 分值 反應(yīng) 分值 紅斑 水腫無紅斑 0 無水腫 0略見紅斑 1 稍有水腫 1中度紅斑 2 明顯可見(邊緣高出皮膚) 2嚴重紅斑 3 皮膚隆起水腫輪廓清晰 3紫色紅斑并有焦痂形成 4 水中隆起1mm 4 總分 8皮膚刺激反應(yīng)評分皮膚原發(fā)性刺激試驗

17、二、眼原發(fā)性刺激試驗眼原發(fā)性刺激試驗（eye primary irritation test）包括單次和多次眼刺激試驗等。觀察終點:眼刺激和眼腐蝕。眼刺激性（eye irritation）：眼睛前表面接觸受試物后產(chǎn)生的眼睛可逆性炎性變化。眼腐蝕性（eye corrosion）：眼睛前表面接觸受試物后產(chǎn)生的眼睛不可逆性組織損傷。動物：健康家兔，至少4只方法： 0.1ml受試物 滴入每只兔的一只眼睛，另一只做為 對照 滴入后可不沖洗，也可在滴入后不同時間（如4秒及30秒）沖洗，觀察眼睛的變化. 于染毒后24、48、72小時、4天和7天時以肉眼或手提式裂隙燈檢查眼的反應(yīng)，包括，結(jié)膜（發(fā)紅、球結(jié)膜水腫和分泌物）、角膜（混濁程度和范圍）和虹膜（充血、腫脹和角膜周圍充血）的反應(yīng)，按規(guī)定分級標準進行評分。Draize 試驗眼原發(fā)性刺激試驗其它局部刺激試驗根據(jù)實際人可能接觸途徑，如眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、關(guān)節(jié)腔、皮膚、直腸、陰道、靜脈、動脈、肌肉、皮下、靜脈旁和鞘內(nèi)等非口服途經(jīng)給藥，觀察用藥局部產(chǎn)生的毒性（如刺激性和過敏性）都應(yīng)進行局部刺激性試驗。 Klaassen CD: Casarett & Doulls Toxicology-The Basic Science of Poisons. 6nd New York:The McGraw-Hill I