多聚酶鏈式反應擴增片斷

1、關(guān)于多聚酶鏈式反應擴增片斷第1頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三分子生物學研究中最強大的實驗技術(shù)之一其本質(zhì)是在體外模擬胞內(nèi)DNA分子復制的過程美國科學家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎 第2頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三.DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:一.基礎(chǔ)知識脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）第3頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三一個核苷酸上的磷酸基團上的“OH”和另一個核苷酸分子

2、的第3位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二酯鍵，即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3和5碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3、5、磷酸二酯鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“OH”末端稱為3端，而磷酸基團的末端稱為5端3.多脫氧核苷酸鏈得形成多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖第4頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三4.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu).DNA分子是由 的（即一條鏈為35，另一條鏈為53）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則 結(jié)構(gòu)。. 與 交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架； 排列在鏈的內(nèi)側(cè)。.兩條鏈上的堿基通過 連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特

3、定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與 配對， 一定同胞嘧啶配對。雙螺旋兩條反向平行脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥嘌呤第5頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三.DNA的復制2.時期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期。3.場所細胞核（主要）、線粒體、葉綠體。1.概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程。4.基本條件酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四種脫氧核苷酸模板:DNA的兩條鏈第6頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三.邊解旋邊復制(過程）5.復制特點.半保留復制（結(jié)果）6.遵循原則：堿基互補配對原則7.精確復制的原因8.復制的意義DNA分子通過復制

4、使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復制提供了精確的模板堿基互補配對能力保證了復制準確無誤的進行第7頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三總結(jié)：胞內(nèi)DNA復制的基本體系打開DNA雙鏈提供DNA復制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸第8頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三(二）PCR原理及條件1概念：PCR即_，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)。它能以極少量的_為模板，在短時間內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝。多聚酶鏈式反應DNA2DNA的平面結(jié)構(gòu)：AGCT5端3端氫鍵

5、ATGC3端: -OH端5端:磷酸基團的末端注意：1、DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3端延伸DNA鏈，因此，DNA復制需要引物 2、DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸第9頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三（1）、 DNA 分子的熱變性原理DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100）復性（緩慢冷卻）變性的目的：復性的目的：解開雙鏈有利于引物與兩條單鏈結(jié)合 在80100 的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性。3、PCR原理第10頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三在80100C的溫度范圍內(nèi)， DNA的雙螺旋

6、結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性.當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈. 高溫雖然打開了雙鏈，可會導致酶失活。怎么辦？ 第11頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三耐高溫的Taq DNA聚合酶解決了高溫導致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化.3、 Taq DNA聚合酶的應用第12頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三（3）、PCR 反應的條件DNA模板；分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物（引物和引物）；四種脫氧核苷酸；耐高溫的聚合酶（Taq DNA聚合酶）；控制溫度，但不需解旋酶；需要在一定的緩沖液中進行。第13頁

7、，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三1234522557294時間（min）溫度（）適溫延伸高溫變性低溫復性重復13步30輪（2）、步驟：變性 復性延伸第14頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（ RNA）打開DNA雙鏈模板合成子鏈原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3端開始連接脫氧核苷酸 思考：3、體內(nèi)DNA復制的條件是什么？ 體外擴增DNA 如何提供相似環(huán)境？ 變性（ 80-100 ）Taq聚合酶（耐高溫）2030個核苷酸構(gòu)成DNA或RNA第15頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期

8、三細胞內(nèi)DNA的復制與PCR的比較第16頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三DNA聚合酶與DNA連接酶的異同第17頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復性好、易自動化等特點。 6 、 PCR技術(shù)的特點第18頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三（五） PCR的反應過程1、PCR的反應步驟PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟變性、復性和延伸變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA

9、雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應作準備2、循環(huán)過程第19頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三靶序列靶序列PCR 循環(huán)第一步 ：加熱變性第20頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三復性（退火） 模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右， 引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合第21頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三靶序列靶序列引物 引物 53553533PCR 循環(huán)第二步 ：引物與靶序列退火第22頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三延伸DNA模板引物

10、結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復制的原理，合成一條新的DNA鏈第23頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三靶序列靶序列引物引物53553533Taq DNA聚合酶PCR 循環(huán)第三步 ：引物延伸第24頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三靶序列 靶序列第1個 PCR 循環(huán)完成后 ：得到兩個拷貝的靶序列第25頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三第26頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三4、循環(huán)特點：上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板 結(jié)果單鏈中有最初母

11、鏈的只兩條（無引物存在于兩個子代DNA分子中 其它子代DNA分子都為雙引物分子式 處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長12N第27頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三4、PCR 循環(huán)的結(jié)果 DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會與引物結(jié)合，進行DNA的延伸第28頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三3、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量第29頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三PCR反應條件： 穩(wěn)定的緩

12、沖液環(huán)境 DNA模板 分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物 A、T、G、C四種脫氧核苷酸 耐熱的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶 能嚴格控制溫度變化的溫控設備第30頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三1、PCR儀.設備及用具實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。二.PCR的實驗操作第31頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。第32頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三微量離心管微量移液器第33頁，共52頁，

13、2022年，5月20日，19點45分，星期三1、準備2、移液（二）實驗操作步驟 按照PCR反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上用微量移液器按照PCR反應體系配方往微量離心管里面加入各種試劑第34頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三過程：蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁注意：3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應液混合均勻A、離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢第35頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s4、離心5、反應

14、離心目的：使反應液體集中在離心管底部， 提高反應效果第36頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三PCR三步曲 預變性保溫 變 性94 30s延伸 721min復性 5530s94 5min第37頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三第38頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：6、注意事項隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭第39頁，共52頁，2022年，5月20日，19

15、點45分，星期三（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算三、課題成果評價1 、一條DNA，復制n次， DNA為2 n2 、 a條DNA，復制n次， DNA為a x2 n（二）實驗中DNA含量的測定1 、原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)第40頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三稀釋2LPCR反應液，加入98L蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零測定取DNA稀釋液100L至比色杯中，測定260nm處的光吸收值計算DNA含量（

16、 g /ml ）50 (260nm的讀數(shù)）稀釋倍數(shù)2.過程第41頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三第42頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三比色杯第43頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三 PCR的突出優(yōu)點快速高效靈活易于操作四、 課題延伸例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）第44頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三五、實驗小結(jié) PCR儀加熱使（ ）變性, 復性使引物與模板DNA（ ）,延伸需將反應溫度升至中溫( ),在（ ）的作用下,以 （ ）為原料,以（ ）為

17、復制的起點,合成新鏈。如此重復改變反應溫度,經(jīng)（ ）三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍; 將擴增產(chǎn)物進行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。模板互補Taq聚合酶四種脫氧核苷酸引物變性、復性和延伸72第45頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三1.提示：繪圖可參考教科書中圖5-9。PCR反應中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應循環(huán)次數(shù)。一個DNA片段在30次循環(huán)后反應物中大約有10億個這樣的片段（2n=230=1 073 741 824)。2.提示：PCR

18、引物是根據(jù)需要擴增的目標DNA的堿基序列來設計的。引物的設計需要豐富的分子生物學實驗經(jīng)驗，感興趣的學生可以參考分子克隆實驗指南（見本專題參考書目），書中有詳盡的論述。書后題第46頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三.理論上DNA擴增數(shù)目的計算三.課題成果評價1.一條DNA，復制n次，DNA為2n2.a條DNA，復制n次，DNA為a2n.實驗中DNA含量的測定1.原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。2.過程.稀釋2uLPCR反應液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋.第47頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三.對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值.計算.計算DNA含量(g)50(260nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù)50：1 g /ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02第48頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三光吸收波長nm2602402202800.10.2第49頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三比色杯第50頁，共52頁，2022年，5月20日，19點45分，星期三五