毛細(xì)管電泳基礎(chǔ)理論課件

1、毛細(xì)管電泳的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用匯報(bào)人： 邵云龍 S201405002 主要內(nèi)容影響分離效率的因素毛細(xì)管電泳特點(diǎn)及應(yīng)用毛細(xì)管電泳歷史發(fā)展致謝毛細(xì)管電泳基礎(chǔ)理論 1930年，Tiselins(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和、球蛋白；發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定； 1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；毛細(xì)管電泳歷史發(fā)展經(jīng)典電泳分析traditional electrophoresis 利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。 按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳； 按載

2、體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳； 傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，后經(jīng)不斷發(fā)展完善，迅速成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)（高效）毛細(xì)管電泳（HPCE）。高效毛細(xì)管電泳 high performance capillary electrophoresis高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)： 一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管柱； 二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。 毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較

3、快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高。 電壓升高，電場推動(dòng)力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長增加， 高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜（一般HPLC柱的N在1000以上），理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。高效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)1.儀器簡單、易自動(dòng)化 電源、毛細(xì)管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高 在3.1min內(nèi)分離36種無機(jī)及有機(jī)陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子；分離柱效：105107/m理論塔板數(shù)；3.操作方便、消耗少 進(jìn)樣量極少，進(jìn)樣量 110 nL 樣品量 5ul5 mL，水介質(zhì)中進(jìn)行；4.應(yīng)用范圍極廣 有機(jī)物、無機(jī)物、生物、中性分子；生物

4、大分子等； 分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護(hù)、材料等； 高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用手性化合物1堿性藥物分子2法醫(yī)毒物/臨床毒理3蛋白質(zhì)/多肽/氨基酸4糖類/糖蛋白5核酸/核苷酸6無機(jī)及有機(jī)離子/有機(jī)酸7水溶液中分子間的相互作用8單細(xì)胞分析9藥物與細(xì)胞的相互作用10毛細(xì)管 接觸 解離 定域電荷 吸附離子 雙電層雙電層 Zeta電勢備注： pH3Si-O-H Si-O-電泳與電滲備注：V電滲是V電泳的5-7倍 （1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性； 在HPCE中，控制電滲流非

5、常重要電滲流的大小電滲流的大小用電滲流速度uos表示，取決于電滲淌度os和電場強(qiáng)度E。即 uos = os E電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的Zeta電勢，即os = 00真空介電常數(shù)；介電常數(shù)；毛細(xì)管壁的Zeta電勢。HPCE中影響電滲流的因素1.電場強(qiáng)度的影響 uos = os E (E = U / d) uos U2.毛細(xì)管材料的影響 不同材料毛細(xì)管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；4. 溫度的影響 毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”； 焦耳熱：毛細(xì)管溶液中有電流通過時(shí)，產(chǎn)生的熱量； HPCE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場強(qiáng)度

6、成正比。 溫度每變化1攝氏度，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%3%；HPCE中影響電滲流的因素5 添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽（K2SO4） 溶液離子強(qiáng)度增大溶液的黏度增大，電滲流減?。?）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向 加入陽離子表面活性劑減小電滲流。 加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS） 壁表面負(fù)電荷增加 zeta電勢增大電滲流增大；（3）加入有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。HPCE中影響電滲流的因素因素結(jié)果說明電場強(qiáng)度正比于電滲.電場強(qiáng)度分離效率和分辨率.電場強(qiáng)度，焦耳熱緩沖溶液pH值pH降低，電滲降低pH降低，電滲增加.改變電滲最方便有用的方法.可能

7、引起溶質(zhì)組分電荷和結(jié)構(gòu)的改變離子強(qiáng)度或緩沖溶液濃度離子強(qiáng)度Zeta電位 ，電滲.離子強(qiáng)度 ，電流和焦耳熱.低離子強(qiáng)度可能存在樣品吸附問題.導(dǎo)電性與樣品不同或引起峰形畸變.離子強(qiáng)度低，樣品裝載量小溫度溫度改變1，黏度變化約2%-3%.溫度由儀器自動(dòng)控制，常用方法有機(jī)改性劑改變Zeta電位黏度（降低電滲）.變化復(fù)雜，其影響宜通過實(shí)驗(yàn)測定.可能改變選擇性HPCE中影響電滲流的因素1.絕對淌度(absolute mobility)ab 無限稀釋溶液中帶電離子在單位電場強(qiáng)度下的平均遷移速度，簡稱淌度?？稍谑謨灾胁殚啞?.有效淌度(effective mobility)eff 實(shí)際溶液中的淌度(實(shí)驗(yàn)中測定

8、的)。 eff=aii ai 溶質(zhì)i 的解離度；i 溶質(zhì)i 在解離狀態(tài)下的絕對淌度3.表觀淌度 uap 離子在實(shí)際分離過程中的遷移速度（表觀遷移速度）： uap=ap E ap= eff+ os (電滲淌度)毛細(xì)管電泳分離的相關(guān)參數(shù)分離效率1.遷移時(shí)間t（保留時(shí)間） HPCE兼具有電化學(xué)的特性和色譜分析的特性。有關(guān)色譜理論也適用。V外加電壓；L毛細(xì)管總長度；表觀淌度 uap2.分離效率（塔板數(shù)） 在HPCE中，僅存在縱向擴(kuò)散，2=2Dt 擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴(kuò)散系數(shù)大的分離效率高，分離生物大分子的依據(jù)。毛細(xì)管電泳分離的相關(guān)參數(shù)3.分離度 影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細(xì)管有效長度Ld與總長

9、度L的比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計(jì)算：毛細(xì)管電泳分離的相關(guān)參數(shù)2.縱向擴(kuò)散的影響 在HPCE中，縱向擴(kuò)散引起的峰展寬：2=2Dt 由擴(kuò)散系數(shù)和遷移時(shí)間決定。大分子的擴(kuò)散系數(shù)小，可獲得更高的分離效率，大分子生物試樣分離的依據(jù)。3.進(jìn)樣的影響 當(dāng)進(jìn)樣塞長度太大時(shí)，引起的峰展寬大于縱向擴(kuò)散。分離效率明顯下降；實(shí)際操作時(shí)進(jìn)樣塞長度小于或等于毛細(xì)管總長度的1%2%。影響分離效率的因素區(qū)帶展寬3.焦耳熱與溫度梯度的影響 電泳過程中會(huì)產(chǎn)生的大量焦耳熱。在散熱過程中，在毛細(xì)管內(nèi)形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導(dǎo)致區(qū)帶展寬。 改善方法： （1）減小毛細(xì)管內(nèi)徑； （2）控制散熱。影響分離效率的因素區(qū)帶展寬5 、其他影響因素（1）電分散作用對譜帶展寬的影響 當(dāng)溶質(zhì)區(qū)帶與緩沖溶液區(qū)帶的電導(dǎo)不同時(shí)，也造成譜帶展寬；盡量