基因工程操作步驟

1、關(guān)于基因工程的操作步驟第1頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四基因工程的基本操作程序1.目的基因的獲取2.基因表達載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細胞4.目的基因的檢測與鑒定第2頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第3頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四知識點一：1.原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，

2、并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落)第4頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結(jié)構(gòu)有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 啟動子終止子第5頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第6頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子

3、不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子 外顯子 啟動子終止子編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 內(nèi)含子： 外顯子： 知識點一：2.真核細胞的基因結(jié)構(gòu)第7頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四真核細胞的 基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點等。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子 外顯子 啟動子終止子編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 第8頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四原核細胞真核細胞

4、不同點編碼區(qū)是_的編碼區(qū)是間隔的、_的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具有調(diào)控作用的_區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第9頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定知識點二.基因工程基本操作的四個步驟第10頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第11頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四一、獲取目的基因1.獲取目的基因的途徑 A.從自然界已有的物種中分離 B.人

5、工合成2.獲取目的基因的方法 A.從基因文庫中獲取 B.利用PCR技術(shù)擴增 C.利用化學方法人工合成目的基因主要是_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因第12頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸熘兄苯荧@取1.基因文庫：概念見P92.基因文庫的分類:按外源DNA片段的來源分類種類基因組DNA文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因， 如：cDNA文庫3.基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。4.獲取目的基因的根據(jù)：見課本P9第13頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四提取某種生物的

6、全部DNA用適當?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導入受體菌中儲存基因組文庫5.基因文庫的構(gòu)建方法之一（1）直接分離法(鳥槍法)第14頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四cDNA合成過程 第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。 5.基因文庫的構(gòu)建方法之第15頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四基因組文庫和部分基

7、因組文庫(cDNA文庫)比較第16頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四 概念：PCR全稱為_，是一項在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù) 聚合酶鏈式反應(yīng)體外特定DNA片段原理：DNA復(fù)制2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因第17頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四四種脫氧核苷酸(dNTP) 一對引物：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA( 需含有目的基因 ) Mg2+(激活劑)條件：緩沖溶液一對寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物前提：第18頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四利用PCR技術(shù)

8、擴增目的基因原理:DNA雙鏈復(fù)制前提:要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。第19頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四 過程高溫變性（解旋為單鏈）低溫退火（引物與單鏈互補結(jié)合）適溫延伸（在Taq酶的作用下合成 與模板互補的DNA雙鏈）重復(fù)循環(huán)預(yù)變性（增加DNA變性的概率）第20頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四2、具體過程第21頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR(多聚酶鏈式反應(yīng))第22頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四 概念：PCR全稱為_，是一項在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù) 條件：_、

9、_、_ 、 _.等原理：_方式：以_方式擴增，即_（n為擴增循 環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：聚合酶鏈式反應(yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）第23頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四過程：a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下，_斷裂，形成_b、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的_。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第24頁，共46頁，2022年，5月20

10、日，8點15分，星期四PCR技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結(jié)果堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子第25頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四目的基因的mRNA單鏈DNA (cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成1）反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸

11、序列目的基因推測推測化學合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 ：3、人工合成的目的基因第26頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四二、基因表達載體的構(gòu)建 基因工程的核心1、目的：所需物質(zhì)：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。第27頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四2、基因表達載體的組成：復(fù)制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因第28頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRN

12、A，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來第29頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。注意第30頁，共46頁，2022年，5月

13、20日，8點15分，星期四三、將目的基因?qū)胧荏w細胞-植物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力第31頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四將目的基因?qū)胧荏w細胞-動物細胞顯微注射法第32頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四將目的基因?qū)胧荏w細胞-微生物細胞Ca2+處理 使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中的DNA-感受態(tài)細胞第33頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四四、目的基因的檢測與鑒定檢測:是否插入目的基因（DNA分子雜交技術(shù)）是否轉(zhuǎn)錄（mRNA分子雜交技術(shù)）是否翻譯（抗原抗體雜交

14、技術(shù)）鑒定:功能活性鑒定抗性鑒定分別提取什么進行檢測歸納步驟第34頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四DNA分子雜交示意圖 采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 第35頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四歸納: 基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學方法人工合成構(gòu)建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：

15、是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯第36頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第37頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四基因操作的基本步驟第38頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四基因操作的基本步驟第39頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處，DNA連接酶作用于 處。（填“a”或“b”）aa第40頁，共46頁，202

16、2年，5月20日，8點15分，星期四練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和 法。（3）由導入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用 技術(shù)，該技術(shù)的核心是 和 。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的 作探針進行分子雜交檢測，又要用 方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性?；驑尫ǎɑǚ酃芡ǖ婪ǎ┲参锝M織培養(yǎng)脫分化和再分化耐鹽基因一定濃度鹽水澆灌第41頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四1）以下說法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體 C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C練習第42頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是 A、能復(fù)制 （ ） B、有多個限制酶切點 C、具有標記基因 D、它是環(huán)狀DNAD練習第43頁，共46頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（ ） A、