基因在大腸桿菌酵母中高效表達(dá)

1、關(guān)于基因在大腸桿菌酵母中的高效的表達(dá)第1頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四前言基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程?；蚬こ讨饕繕?biāo)之一是生產(chǎn)常規(guī)方法難以生產(chǎn)的大量蛋白質(zhì)產(chǎn)物即實(shí)現(xiàn)基因的高效表達(dá)?；蚋咝П磉_(dá)研究是指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng)，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。第2頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四最佳的基因表達(dá)體系：目的基因的表達(dá)產(chǎn)量高;表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定;生物活性高;表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化。第一節(jié)基因的表達(dá)系統(tǒng)與表達(dá)策略第3頁，共33頁，2022年，5月20

2、日，5點(diǎn)53分，星期四宿主細(xì)胞的選擇一、適合目的基因表達(dá)的宿主細(xì)胞的要求: 1、容易獲得較高濃度的細(xì)胞； 2、能利用易得廉價(jià)原料； 3、不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素； 4、發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)； 5、容易進(jìn)行代謝調(diào)控； 6、容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作； 7、產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高， 8、產(chǎn)物容易提取純化。第4頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四二、宿主細(xì)胞分為兩大類：1、原核細(xì)胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、 鏈霉菌等；2、真核細(xì)胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。第5頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四大腸桿菌目前仍是基因工程研究中采

3、用最多的原核表達(dá)體系。優(yōu)越性：對(duì)大腸桿菌的基礎(chǔ)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等背景知識(shí)和基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理已有了深刻了解。有各類菌株和載體系列。目前以實(shí)現(xiàn)多種基因的高效表達(dá)。表達(dá)基因產(chǎn)物形式多樣:細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)(包含體)、細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)等。易培養(yǎng)，成本低。第6頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四缺點(diǎn)：大腸桿菌中的表達(dá)不存在信號(hào)肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難。因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)變性復(fù)性才恢復(fù)活性。蛋白質(zhì)不能糖基化。產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個(gè)蛋氨酸殘基。其內(nèi)毒素很難除去。 第7頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四酵

4、母 酵母菌是研究基因表達(dá)最有效的單細(xì)胞真核微生物。其基因組小，世代時(shí)間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達(dá)。第8頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四基因表達(dá)的基本過程第9頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四基因表達(dá)的基本過程 基因的表達(dá)主要涉及到兩個(gè)過程：轉(zhuǎn)錄和翻譯。 首先，目的基因通過轉(zhuǎn)錄(transcription)形成mRNA（信使RNA, messenger RNA )； 然后， tRNA （轉(zhuǎn)運(yùn)RNA, transfer RNA）將各種氨基酸運(yùn)送到核糖體并按照mRNA的密碼子順序?qū)⒏鞣N氨

5、基酸連接成特定的氨基酸序列(translation) 最終得到基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）。第10頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四Transcription(轉(zhuǎn)錄): making an RNA copy of a DNA sequence . RNA polymerase opens the part of the DNA to be transcribed. Only one strand of DNA (the template strand, antisense strand) is transcribed. 轉(zhuǎn)錄的具體過程第11頁，共33頁，2022年，5月20日

6、，5點(diǎn)53分，星期四 啟動(dòng)子（promoter）：在基因序列中，標(biāo)志著轉(zhuǎn)錄起始的可被RNA聚合酶識(shí)別的位點(diǎn)(DNA區(qū)段)，一般位于基因的上游。 終止子（terminator）：位于基因的編碼序列之外（一般在下游）的一段標(biāo)志著轉(zhuǎn)錄停止的RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)。有效轉(zhuǎn)錄的基本條件第12頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四正確翻譯的基本條件1、具備起始密碼子2、具備終止密碼子3、具有正確的閱讀框第13頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四基因表達(dá)的基本過程第14頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四根據(jù)表達(dá)蛋白用途選擇基因的表達(dá)策略一、生物化學(xué)和

7、分子生物學(xué)研究二、表達(dá)蛋白質(zhì)用作抗原三、結(jié)構(gòu)研究第15頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四真核基因表達(dá)的特點(diǎn)一條成熟的mRNA只能翻譯成一條多肽，不存在象原核生物那樣的多基因操縱子模式；基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)很大，而且往往遠(yuǎn)離啟動(dòng)子達(dá)幾百個(gè)甚至上千個(gè)堿基，它們并不直接影響RNA聚合酶與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，而是通過改變基因5上游區(qū)DNA的構(gòu)型來影響RNA聚合酶與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合；mRNA合成后穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中后才進(jìn)行翻譯工作，而且通常都有復(fù)雜的成熟和剪接過程；基因的啟動(dòng)子區(qū)和原核基因差異很大，而且有增強(qiáng)子序列存在。第16頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四原核體系中

8、表達(dá)真核基因的困難細(xì)菌的RNA聚合酶不識(shí)別真核基因的啟動(dòng)子；真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA在原核細(xì)胞中不能結(jié)合到核糖體上；真核基因一般含有內(nèi)含子，而原核細(xì)胞沒有象真核細(xì)胞那樣的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，所以mRNA中的內(nèi)含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表達(dá)出有功能的真核蛋白；表達(dá)的真核蛋白在原核細(xì)胞中很不穩(wěn)定，容易被細(xì)菌蛋白酶降解破壞。第17頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四將真核基因克隆到一個(gè)強(qiáng)大的原核啟動(dòng)子和SD序列的下游，使得真核基因處于原核調(diào)控體系中。采用真核基因的cDNA序列作為構(gòu)建表達(dá)載體的目的基因，這樣就解決了原核細(xì)胞沒有RNA剪接功能的問題。構(gòu)建載體時(shí)，將

9、真核基因插在幾個(gè)原核密碼子的后面，翻譯后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，這樣就可以避免被原核蛋白酶的識(shí)別和降解，最后可以將融合多肽切除。構(gòu)建表達(dá)載體的策略第18頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四第二節(jié) 克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá) R3510SD編碼序列OriTcrTT啟動(dòng)子起始密碼子AUG、GUG、UUG終止密碼子UAAU、UGA、UAG大腸桿菌表達(dá)載體的成份 大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體一般是質(zhì)粒表達(dá)載體，含有大腸桿菌內(nèi)源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)和有關(guān)序列組成的能在大腸桿菌中有效復(fù)制的復(fù)制子。第19頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四大腸桿菌表達(dá)載體

10、的成份啟動(dòng)子 要求是：強(qiáng)啟動(dòng)子是誘導(dǎo)性的，如熱誘導(dǎo)和化學(xué)誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄終止子 使轉(zhuǎn)錄終止，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性，提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)水平。 尤其是將兩個(gè)終止子串聯(lián)，轉(zhuǎn)錄終止功能更強(qiáng)。核糖體結(jié)合位點(diǎn) 在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游的一段DNA序列（SD，5AGGAGG3）(4)篩選標(biāo)記基因 (5)密碼子的選擇第20頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)T7表達(dá)系統(tǒng)T7噬菌RNA聚合酶能選擇性的激活T7噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，其mRNA合成速率相當(dāng)于大腸桿菌RNA聚合酶的5倍。Lac表達(dá)系統(tǒng)是-半乳糖苷酶編碼基因LacZ的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列，該啟動(dòng)子可以被IPTG誘導(dǎo)，所以在培養(yǎng)基

11、中加入該安慰誘導(dǎo)物就可以誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。Tac表達(dá)系統(tǒng)是一種由Lac和Trp啟動(dòng)子雜合而成的啟動(dòng)子，其強(qiáng)度得到了很大的提高，也可被IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。PL表達(dá)系統(tǒng)是負(fù)責(zé)DNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子之一，是一種極強(qiáng)的啟動(dòng)子。第21頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四影響克隆基因表達(dá)效率的因素 一般而言，所用啟動(dòng)子的強(qiáng)度、DNA的轉(zhuǎn)錄起始序列、密碼子的選擇、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄的終止、基因的拷貝數(shù)等都會(huì)在一定程度上影響到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響 大多數(shù)大腸桿菌啟動(dòng)子都含有兩種保守區(qū),即-10區(qū)(位于轉(zhuǎn)錄其始位點(diǎn)上游5-10bp，故稱為-10區(qū)，序列為5-TAT

12、AAT)和-35區(qū)(位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25bp處，一般有10bp組成， 5- TTGACA故稱為-35區(qū)，)。當(dāng)然，實(shí)際的啟動(dòng)子中很少具備與上述序列完全一致的區(qū)域，但是研究表明，啟動(dòng)子的這兩個(gè)區(qū)域與上述保守序列的相似程度越高，該啟動(dòng)子的表達(dá)能力也就越強(qiáng)。另外，這兩個(gè)保守區(qū)間的距離也是影響啟動(dòng)子強(qiáng)度的重要因素，即這個(gè)間距越是接近于17bp，啟動(dòng)子的活性就越強(qiáng)。第22頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四b. 翻譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響 mRNA的有效翻譯依賴于核糖體和其的穩(wěn)定結(jié)合，大腸桿菌的mRNA序列中，核糖體的結(jié)合位點(diǎn)是起始密碼子AUG和其上游的SD序列。所謂SD序列就

13、是由Shine-Dalgarno首先提出的一種位于位于起始密碼子上游的一段保守序列，為細(xì)菌核糖體有效結(jié)合和翻譯起始所必需。一般SD序列的長(zhǎng)度約為3-9bp，位于起始密碼子上游3-11堿基的位置，它與16S核糖體RNA的3端互補(bǔ)，控制了翻譯的起始。-AGGAGGUXXXAUG- mRNAAUUCCUCCACUAG-16S rRNA3 末端第23頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四c. 啟動(dòng)子與克隆基因間的距離對(duì)基因表達(dá)的影響 研究表明啟動(dòng)子和目的基因間的距離對(duì)基因的表達(dá)效率影響很大，所以在構(gòu)建新的表達(dá)載體時(shí)要考慮到這一因素的影響。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的終止子序

14、列，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞能量的大量消耗，或是形成不應(yīng)有的二級(jí)結(jié)構(gòu)，最終影響的目的基因的表達(dá)效率。PromoterSDAUGGeneTerminatorUAAmRNA第24頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四蛋白質(zhì)的融合表達(dá)融合表達(dá)一般是將基因引入某表達(dá)載體編碼的高表達(dá)蛋白（擔(dān)體蛋白）序列的3末端。表達(dá)出來的融合蛋白的N末端含有由擔(dān)體序列編碼的片段。融合蛋白可以直接用作抗體，但通常是將N端的擔(dān)體蛋白部分從C端的目的蛋白中裂解出來，有利于對(duì)目的蛋白進(jìn)行生化研究及功能分析。方法主要有：化學(xué)裂解法和酶解法。第25頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四蛋白質(zhì)的分泌型表達(dá)將

15、目的蛋白的基因置于原核蛋白信號(hào)肽序列的下游有可能實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分泌表達(dá)有許多有利之處：1.在穿膜過程中信號(hào)肽被信號(hào)肽酶切除。生產(chǎn)的蛋白質(zhì)和天然蛋白質(zhì)是一致的。2.周質(zhì)中蛋白酶活性低，分泌的蛋白穩(wěn)定。3.周質(zhì)中細(xì)菌的蛋白很少，使得重組蛋白易純化。4.周質(zhì)中提供了一個(gè)氧化環(huán)境，更有利于二硫鍵的正確形成。 因此，對(duì)于許多難以純化的蛋白質(zhì)可以通過分泌表達(dá)來實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)。第26頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四蛋白質(zhì)的包含體形式表達(dá)重組蛋白在大腸桿菌中高表達(dá)時(shí)，絕大多數(shù)是以包含體形式存在的。包含體就是表達(dá)的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)聚集成沒有生物活性的固體顆粒。不可溶、無生物活性的包含體

16、必需經(jīng)過變性、復(fù)性才能獲得天然結(jié)構(gòu)及生物活性。第27頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四減少包含體形成的策略：1.降低重組菌的生長(zhǎng)溫度。2.添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長(zhǎng)添加劑。如高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖。3.供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件，如供氧、pH值等。 不過，包含體的形成有時(shí)也是有利的，不僅可以獲得高表達(dá)、高純度的蛋白質(zhì)，還可避免細(xì)胞水解酶對(duì)重組蛋白的破壞。第28頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四有效、理想的復(fù)性方法應(yīng)具備一下幾個(gè)特點(diǎn)：1.活性蛋白質(zhì)的回收率高。2.正確復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)分離。3.折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。4.折疊復(fù)性方法利用放大。5.復(fù)性過程耗時(shí)較少。第29頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四第三節(jié)基因在酵母中的高效表達(dá)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的缺陷：1.缺失真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后修飾和加工，如剪切、糖基化、形成二硫鍵等。2.表達(dá)的蛋白多以包含體形式存在，需要經(jīng)過復(fù)雜的復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象和生物活性。 因此，可以使用真核生物酵母作為表達(dá)菌。如釀酒酵母、甲醇酵母等。第30頁，共33頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)53分，星期四甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)甲醇酵母能利用甲醇為其唯一碳源。甲醇代謝的第一步是甲醇在乙醇氧化酶作用下氧化成甲醛，乙