基因克隆以及蛋白表達(dá)

1、關(guān)于基因克隆及蛋白表達(dá)第1頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四研究某一目的基因功能一般策略 目的DNA獲得來(lái)自三條途徑:1. genome上的特定區(qū)域或序列2. 含有目的DNA的質(zhì)粒3. 從cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增單個(gè)已知cDNA獲得目的DNA構(gòu)建含目的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌蛋白表達(dá)純化轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞蛋白定位、表達(dá)及表型變化第2頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四第一部分PCR第3頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是20世紀(jì)80年代后期由K.

2、Mullis等建立的一種體外酶促擴(kuò)增特異DNA片斷的技術(shù)。PCR是利用針對(duì)目的基因所設(shè)計(jì)的一對(duì)特異寡核苷酸引物，以目的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行的DNA體外合成反應(yīng)。PCR技術(shù)具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。第4頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四一、PCR實(shí)驗(yàn)原理第5頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四一、PCR實(shí)驗(yàn)原理第6頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四二、PCR的反應(yīng)體系 1. PCR引物（1） primer 長(zhǎng)度：18-30bp 引物短特異性降低 引物長(zhǎng)影響產(chǎn)物生成（2） primer 濃

3、度：0.1-1.0 umol/L 濃度過(guò)高錯(cuò)配、引物二聚體增加 濃度過(guò)低PCR效率降低第7頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四二、PCR的反應(yīng)體系 2. 緩沖液 KCl、Tris-Cl、MgCl2 ， Mg2+：1.52.0 mM Mg2+ : DNA聚合酶 活性 PCR產(chǎn)量 Mg2+ : PCR反應(yīng)特異性第8頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四二、PCR的反應(yīng)體系 3. DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 LA DNA聚合酶 Prime STAR (Pyrobest DNA聚合酶 ) Pfu DNA聚合酶第9頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)1

4、3分，星期四第10頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四第11頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四Taq DNA polymerase5533533553 DNA聚合酶活性。在模板和引物存在的條件下，以dNTP作為底物，沿53方向合成與模板互補(bǔ)的DNA第12頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四LA Taq DNA Polymerase1. 53 DNA聚合酶活性；2. 35 DNA外切酶活性。第13頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四Pyrobest & pfu DNA Polymerase Taq DNA 聚合酶活

5、性 35外切酶活性，可信度極高 PCR產(chǎn)物為平滑末端第14頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四PCR的反應(yīng)體系4dNTP: 50-200 umol/L5. 模板DNA（1） 單鏈DNA（2） 雙鏈DNA（3） 濃度：基因組DNA：1ug 質(zhì)粒DNA：10ng第15頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四三、基本操作步驟1.變性(denature):95高溫下,雙螺旋氫鍵斷 裂,雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA2.退火(annealing):兩條引物與模板DNA擴(kuò)增區(qū) 域的兩端按堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合.3.延伸(extension):在4種dNTP底物及Mg2+存在 條

6、件下,Taq DNA聚合酶在72下,將單核 苷酸按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則從引物3端摻 入,使引物沿53方向延伸合成新股DNA第16頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四四、條件優(yōu)化1.變性: 95變性20-30s,即可使各種DNA完全變性。2.退火:引物與模板退火溫度由引物長(zhǎng)度和GC%決定,退火溫度一般應(yīng)比Tm值低4-12 為宜,退火時(shí)間一般為20-40s。3.延伸:通常68-75。延伸時(shí)間取決于擴(kuò)增片斷的長(zhǎng)度. 可以500bp/30s為基準(zhǔn)，根據(jù)目的片斷的長(zhǎng)度計(jì)算反應(yīng)時(shí)間。4.循環(huán)次數(shù)：一般為25-35次。第17頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四PCR反應(yīng)液

7、PCR Buffer（Mg2+） 2.5ldNTP混合物（各2.5mM） 4l模板DNA 1l引物1（20uM） 0.5l引物2（20uM） 0.5lTaq DNA polymerase（5U/ul） 0.25lddH2O至 25l第18頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四PCR反應(yīng)條件 94 5min94 30sec55 30sec 30 Cycles72 1min72 10min 4 forever第19頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四五、PCR引物的設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)成功的一個(gè)關(guān)鍵條件是正確設(shè)計(jì)引物PCR引物設(shè)計(jì)目的是在擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率兩個(gè)目標(biāo)

8、上取得平衡.可以利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),引物設(shè)計(jì)軟件會(huì)通過(guò)每一引物設(shè)計(jì)變化的預(yù)定值在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡,找出最佳引物.有時(shí)也需根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體要求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整.第20頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四引物設(shè)計(jì)的基本原則 (一)引物長(zhǎng)度在16-30bp范圍內(nèi),以18-24bp為最佳.引物過(guò)短,產(chǎn)物特異性降低,每增加一個(gè)核苷酸,引物特異性可增加4倍.引物的長(zhǎng)度是指與模板DNA序列互補(bǔ)的部分,不包括為后續(xù)克隆而加的酶切位點(diǎn)與額外序列.第21頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四引物設(shè)計(jì)的基本原則(二)引物末端1.引物的3末端對(duì)于PCR反應(yīng)是關(guān)鍵.2.引物的3

9、末端的第一和第二個(gè)堿基影響Taq DNA聚合酶的延伸效率,故其影響PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率及特異性.引物3末端最佳堿基選擇G或C，因?yàn)樗鼈冃纬傻膲A基配對(duì)比較穩(wěn)定。第22頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四引物設(shè)計(jì)的基本原則3. 引物5末端的堿基無(wú)嚴(yán)格限制當(dāng)引物的長(zhǎng)度足夠時(shí), 引物5末端的堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)。可在5端加上限制內(nèi)切酶位點(diǎn),啟動(dòng)子序列或其他序列等,以便于PCR產(chǎn)物的分析克隆。第23頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四引物設(shè)計(jì)的基本原則4.在一個(gè)PCR反應(yīng)中的一對(duì)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,特別是3末端應(yīng)盡量避免互補(bǔ),以免形成“引物二

10、聚體”造成引物浪費(fèi)和非特異性的擴(kuò)增.5.每個(gè)引物的內(nèi)部應(yīng)盡量避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu),特別是引物的末端應(yīng)無(wú)回文結(jié)構(gòu).第24頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四引物設(shè)計(jì)的基本原則(三)引物的GC含量和Tm值PCR引物G+C堿基的含量應(yīng)保持在45-65%之間，G+C含量一般為40-60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。PCR擴(kuò)增中的復(fù)性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5-10度。引物長(zhǎng)度小于20bp時(shí), Tm=4(G+C)+2(A+T) 。第25頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四引物設(shè)計(jì)的基本原則(四)引物的

11、位置1.引物的序列應(yīng)位于基因組DNA的高度保守區(qū)，且與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序列，這樣可減少引物與基因組的非特異結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性。2.若以cDNA為模板，則首先應(yīng)盡量使引物和產(chǎn)物保持在mRNA的編碼區(qū)域內(nèi)；其次，盡量把引物放在不同的外顯子上，以便使特異的PCR產(chǎn)物與從污染DNA中產(chǎn)生的產(chǎn)物在大小上相區(qū)別。第26頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四引物設(shè)計(jì)的基本原則（五)Primer primer 5.0輔助的引物設(shè)計(jì)步驟及條件優(yōu)化第27頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四第二部分RT-PCR第28頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四RT

12、-PCR是將RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR結(jié)合起來(lái)建立的一種PCR技術(shù)。首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，然后進(jìn)行常規(guī)PCR。第29頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四cDNA合成 Superscript first-strand synthesis system for RT-PCR 是從總RNA或mRNA合成cDNA。RNA量為1ng5ug。第30頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四Reverse Transcriptase553353351.依賴于RNA的 53 DNA聚合酶活性（反轉(zhuǎn)錄活性）；2.依賴于DNA的 53 DNA聚合酶活性。第31頁(yè)，共86頁(yè)，202

13、2年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四Reverse TranscriptaseRNADNADNA3.RNase H 活性：特異性識(shí)別并分解RNA-DNA雜交體中的RNA鏈第32頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四RT-PCR 第33頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（RNase H-）進(jìn)行cDNA第一鏈的合成 RNase H缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MuLV）反轉(zhuǎn)錄酶是一種RNA介導(dǎo)的DNA聚合酶。該酶能以RNA或者單鏈DNA做模板由引物起始合成一個(gè)互補(bǔ)的DNA鏈。RNase H活性的缺失增強(qiáng)了該酶合成長(zhǎng)鏈cDNA的能力。

14、編碼M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶的基因在重組大腸桿菌中表達(dá)，該酶在其RNase H區(qū)域含一點(diǎn)突變，從而使修飾后酶的RNase活性缺失，但反轉(zhuǎn)錄功能不受影響。第34頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（RNase H-）進(jìn)行cDNA第一鏈的合成 進(jìn)行PCR前用Rnase H消化。去除與cDNA結(jié)合的RNA，增加PCR敏感性。第一鏈合成過(guò)程中RNase H降解模板mRNA，導(dǎo)致全長(zhǎng)cDNA合成減少及cDNA第一鏈產(chǎn)量降低。第35頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四cDNA第一鏈的合成有三個(gè)方法 （1） Random hexamers：是最非特異

15、性引物。通常在特異全長(zhǎng)mRNA難以拷貝時(shí)應(yīng)用此引物。利用該方法，以全部RNA做模板合成cDNA。在PCR時(shí)，PCR引物決定其特異性。第36頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四cDNA第一鏈的合成有三個(gè)方法（2）oligo（dT）：較特異和常見(jiàn)的方法, 其cDNA的合成數(shù)量和復(fù)雜性大大低于random hexamers方法,尤其是進(jìn)行新的mRNA RT-PCR時(shí),建議用此方法.第37頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四cDNA第一鏈的合成有三個(gè)方法(3) Gene-specific primer(GSP):最為特異的方法。 利用鄰近mRNA 3末端的PCR

16、引物進(jìn)行cDNA第一鏈合成,但是,某些GSP即使以DNA為模板,能擴(kuò)增出DNA條帶.有時(shí),也不能進(jìn)行cDNA第一條鏈合成.此時(shí)建議用oligo（dT）引物.第38頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四cDNA第一條鏈合成步驟第39頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四第40頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四第三部分克隆第41頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四RNA提取純化RT-PCR質(zhì)粒DNAPCR凝膠回收PCR擴(kuò)增片段目的基因片段T-A克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞藍(lán)白斑篩選質(zhì)粒提取、酶切鑒定連入GST融合表達(dá)載體外源基因克

17、隆到真核表達(dá)載體GST融合蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)化、活性測(cè)定轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞表達(dá)定位得到目的基因片段的T-A克隆第42頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四PCR片段回收利用從瓊脂糖凝膠中回收純化DNA片段的試劑盒。試劑盒采用了獨(dú)特的凝膠融解系統(tǒng)，結(jié)合DNA制備膜技術(shù)，具有高效快速的特點(diǎn)。本試劑盒純化DNA片段純度高，完整性好?？芍苯佑糜谶B接反應(yīng)，PCR擴(kuò)增。 第43頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四第44頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四T-A克隆經(jīng)Taq DNA聚合酶擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物末端都帶有單個(gè)A。正是基于這一原理，pGEM-T質(zhì)粒經(jīng)Eco

18、R V切成平端后，在開(kāi)口端加上一個(gè)T制成T載體，一方面避免了自身環(huán)化，另一方面由于T-A互補(bǔ)，提高了T載體與PCR產(chǎn)物之間的連接效率。 第45頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四第46頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四第47頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四T-Vector第48頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞：限制修飾酶系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體（R，M）。它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（如電擊

19、法，CaCl2）處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞（Competent cells）。第49頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子（Transformant），即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。 第50頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四T-Vector第51頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四進(jìn)行藍(lán)白篩選，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增 IPTG

20、(異丙基-半乳糖苷）是-半乳糖苷酶活性的誘導(dǎo)物,可使lacZ 阻抑物失活，從而誘導(dǎo)lac操縱子轉(zhuǎn)錄。基于這個(gè)特性,當(dāng)PUC系列載體以lacZ缺欠細(xì)胞作為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí), 如果在培養(yǎng)基中加入X-Gal和IPTG,由于-半乳糖苷酶的-互補(bǔ)性,可以根據(jù)是否呈現(xiàn)白色而方便的選擇出基因重組體.第52頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四進(jìn)行藍(lán)白篩選，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增 X-gal: (5-溴-4氫-3-吲哚-D-半乳糖苷) X-gal是E.Coli產(chǎn)生的-半乳糖苷酶的顯色底物。-半乳糖苷酶可將X-gal轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘纳钏{(lán)色沉淀。第53頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星

21、期四進(jìn)行藍(lán)白篩選，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增 雙鏈pGEM-T質(zhì)粒，有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)多克隆位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)處于表達(dá)LacZ基因產(chǎn)物-半乳糖苷酶的氨基端片段。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LacZ基因突變的大腸桿菌株（JM109或DH5）時(shí)，因?yàn)橛少|(zhì)粒表達(dá)的-肽補(bǔ)充了大腸桿菌缺失的-肽，所以恢復(fù)了分解半乳糖的能力。第54頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四進(jìn)行藍(lán)白篩選，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增 在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出藍(lán)色克隆。如果在多克隆位點(diǎn)內(nèi)插入外源DNA，由于它破壞了-肽的表達(dá)，因而在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基，不能長(zhǎng)出藍(lán)色克隆，這就是所謂的藍(lán)白篩選。

22、第55頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四質(zhì)粒的提取及酶切鑒定第56頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四第57頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四第四部分：外源基因的原核表達(dá)第58頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四外源基因的原核表達(dá) 外源基因的表達(dá)是研究和探索基因功能、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的重要方法，亦是制備和生產(chǎn)新型蛋白質(zhì)藥物、新型診斷試劑必不可少的手段。外源基因通過(guò)在宿主細(xì)胞中的表達(dá)可大量獲得其產(chǎn)物。 第59頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四一、原核表達(dá)系統(tǒng)常用的載

23、體及其應(yīng)用 （一）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) （二）大腸桿菌載體的表達(dá)方式 第60頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)。優(yōu)點(diǎn)：遺傳背景清晰、目的基因表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短等；第61頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 缺點(diǎn)：缺少真核生物的蛋白翻譯后修飾和加工過(guò)程，如剪切、糖基化及正確二硫鍵的形成等；表達(dá)的蛋白質(zhì)多以包含體形式存在，需經(jīng)復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象與活性；宿主本身雜蛋白多，純化步驟復(fù)雜。第62頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四大腸桿菌載體的表達(dá)方式 1非融合性表

24、達(dá)載體：此種載體表達(dá)的蛋白質(zhì)與天然狀態(tài)下存在的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、功能和免疫源性等方面基本或完全一致。第63頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四大腸桿菌載體的表達(dá)方式 2融合表達(dá)載體：分子量較小的蛋白質(zhì)可采用這種載體進(jìn)行表達(dá)。優(yōu)點(diǎn)：可增加mRNA和表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性；可應(yīng)用針對(duì)融合蛋白中非目的蛋白片段進(jìn)行親和層析，很容易將融合蛋白純化；通過(guò)融合表達(dá)可產(chǎn)生可溶性蛋白；第64頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四大腸桿菌載體的表達(dá)方式 融合表達(dá)載體主要有以下幾種：谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）系統(tǒng)；-半乳糖苷酶系統(tǒng)；麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）系統(tǒng)；蛋白A系統(tǒng)；與純化標(biāo)簽

25、融合表達(dá)以及其他融合系統(tǒng)。第65頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四大腸桿菌載體的表達(dá)方式 3帶純化標(biāo)簽的表達(dá)載體：目前應(yīng)用較多的純化標(biāo)簽有GST-tag, FLAG-tag, His-tag.4分泌型表達(dá)載體5表面展示表達(dá)載體6帶分子伴侶的表達(dá)載體第66頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四外源基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化第67頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四擴(kuò)增陽(yáng)性克隆并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá) pGEX-5x-1載體帶有IPTG（異丙基-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)啟動(dòng)子，可以表達(dá)外源蛋白的總量可以達(dá)到全菌蛋白的30%以上。 第68頁(yè)，共86頁(yè)

26、，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四SDS電泳 將含有目標(biāo)蛋白的樣品用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分離。利用濃縮膠和分離膠的濃縮效應(yīng)，電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)對(duì)不同分子量大小的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。 第69頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四第70頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四Western BlotGST-Pro-BGST第71頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四RNA提取純化RT-PCR質(zhì)粒DNAPCR凝膠回收PCR擴(kuò)增片段目的基因片段T-A克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞藍(lán)白斑篩選質(zhì)粒提取、酶切鑒定連入GST融合表達(dá)載體外源基因克

27、隆到真核表達(dá)載體GST融合蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)化、活性測(cè)定轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞表達(dá)定位得到目的基因片段的T-A克隆第72頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四Northern印跡雜交是用于檢測(cè)和量化細(xì)胞RNA的一種基本技術(shù)。它主要是將電泳凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，通過(guò)紫外交聯(lián)作用而使RNA與膜永久的結(jié)合在一起，固定在膜上的RNA樣品與特異的探針雜交，從而對(duì)感興趣的RNA進(jìn)行定位。 Northern印跡雜交 第73頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四Northern印跡雜交 一、DNA探針標(biāo)記 在核酸分子雜交中，探針是指用放射性核素或其他標(biāo)記物標(biāo)記的核酸片段，它具有特定的序列，能夠和待測(cè)的核酸片段互補(bǔ)結(jié)合，因此可用于檢測(cè)核酸樣品中的特定基因。第74頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四Northern印跡雜交 一、DNA探針標(biāo)記 用于探針標(biāo)記的標(biāo)記物有放射性核素與非放射性核素兩大類(lèi)，前者是目前最常用的標(biāo)記方式；后者包括生物素、地高辛及熒光素等。第75頁(yè)，共86頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四Northern印跡雜交 一、DNA探針標(biāo)記核酸探針的標(biāo)記方法：1.切口平移法2.隨機(jī)引物法 這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的較為理想的核酸探