基因克隆與克隆基因表達(dá)

1、關(guān)于基因克隆及克隆基因的表達(dá)第1頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 一、目的DNA的分離獲?。ǚ郑┓蛛x獲取目的DNA有多種方法：(一) PCR待擴(kuò)增目的基因兩端序列已知（據(jù)此設(shè)計(jì)引物）(二) 基因文庫(kù)先構(gòu)建，后篩選(三)化學(xué)合成法直接合成目的DNA（序列已知、片段較短）第2頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 文庫(kù)法：一個(gè)細(xì)胞只接受一個(gè)重組DNA分子一般一個(gè)載體只攜帶一段外源DNA 單克隆第3頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 基因組DNA文庫(kù)（genomic DNA library）：包含某一個(gè)生物細(xì)胞或組織全部基因組DNA序列

2、的隨機(jī)克隆群體，以DNA片段的形式貯存了所有的基因組DNA信息。如何從文庫(kù)中釣取基因？第4頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四1234522557294時(shí)間（min）溫度（）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第5頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模

3、板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L第6頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 二、載體的選擇與準(zhǔn)備（擇）；載體（vector）：攜帶外源DNA，實(shí)現(xiàn)外源DNA在受體細(xì)胞中的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。 1.按功能克隆載體（cloning vector）表達(dá)載體（expression vector） 2.按基本元件的來源分類：質(zhì)粒載體噬菌體載體黏粒載體病毒載體人工染色體載體等第7頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 二、載體的選擇與準(zhǔn)備（擇）；（一）根據(jù)DNA克隆的目的選擇與準(zhǔn)備適宜載體1

4、. 獲得目的DNA片段選用克隆載體；2. 獲得目的DNA片段所編碼的蛋白質(zhì)選用表達(dá)載體。（二）考慮目的DNA的大小及受體細(xì)胞的種類和來源（三）含有合適的MCS第8頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四克隆載體用于外源DNA的克隆和無性繁殖 （一）克隆載體（cloning vector）應(yīng)具備的主要特點(diǎn)1.至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)（origin of replication, ori）2.至少有一個(gè)選擇性標(biāo)志（selection marker）3.有適宜的限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)：多克隆位點(diǎn)（multiple cloning sites，MCS）4.應(yīng)有較高的拷貝數(shù)pBR322質(zhì)粒圖譜

5、 第9頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 克隆載體用于外源DNA的克隆和無性繁殖（二）常用克隆載體的種類1.質(zhì)粒(plasmid)是最常用的克隆載體廣泛存在于細(xì)菌、酵母等多種微生物中獨(dú)立于宿主細(xì)胞染色體外的環(huán)狀雙鏈的超螺旋結(jié)構(gòu)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制帶有某些遺傳信息, 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀質(zhì)粒的不相容性：兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象。第10頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 目前，已有一系列商品化質(zhì)?？寺≥d體可供選擇，可容納10kb以內(nèi)的外源DNA 。pUC18/19質(zhì)粒圖譜pUC18/19質(zhì)粒，2686bp，是最常用的質(zhì)粒載體缺乏控制

6、拷貝數(shù)的rop基因，因此其拷貝數(shù)達(dá)500-700 第11頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 T-載體：pMD18-T2692bpAmpicillin resistanceoriginHindIIISplnPstIHincIIAccISalIXbalBamHISmaIXmaIKpnISacIEcoRISp6T7LacZTT第12頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 克隆載體用于外源DNA的克隆和無性繁殖（二）常用克隆載體的種類2.噬菌體(phage)能感染細(xì)菌的病毒（1）噬菌體DNA改造系統(tǒng)cos位點(diǎn):兩端各有一條由12個(gè)堿基組成、彼此完全互補(bǔ)且5突出的

7、序列插入型：gt系列，適用于cDNA克隆置換型：EMBL系列，適用于基因組DNA克隆線性雙鏈DNA分子coscos12bp12bp48500bpNonessential portionfor replicationLong (left) armShort (right) arm（2）M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）單鏈閉合環(huán)狀DNA分子第13頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 克隆載體用于外源DNA的克隆和無性繁殖（二）常用克隆載體的種類3.穿梭載體(shuttle vector) 可在不同宿主細(xì)胞中應(yīng)用人工構(gòu)建，含有不止一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，能攜帶外源DNA序列在不

8、同種類宿主細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增。例如，既能在原核生物中復(fù)制,又能在真核生物中復(fù)制的載體。這類載體不僅具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)及選擇標(biāo)記基因；還有真核生物的自主復(fù)制序列及選擇標(biāo)記性狀；具有多克隆位點(diǎn)。通常穿梭載體：在細(xì)菌中用于克?。〝U(kuò)增克隆的基因）， 在酵母菌中用于基因表達(dá)分析。第14頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 表達(dá)載體用于外源DNA的表達(dá) 表達(dá)載體（expression vector）：用來在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體 依據(jù)其宿主細(xì)胞的不同可分為: 原核表達(dá)載體（prokaryotic expression vector） 真核表達(dá)載體（eukaryotic expr

9、ession vector） 第15頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 三、目的DNA與載體連接（接）T4DNA ligase第16頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 四、重組DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增（轉(zhuǎn)）宿主細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞（competent cell）：處于易于接納外源物質(zhì)的狀態(tài)的細(xì)菌第17頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四轉(zhuǎn)化（transformation） 質(zhì)?；蝠ち＜?xì)菌 質(zhì)粒酵母（真核細(xì)胞）轉(zhuǎn)染（transfection） 外源DNA真核細(xì)胞（酵母除外）感染（infection） 噬菌體顆粒細(xì)菌 病毒顆粒哺乳細(xì)胞 幾

10、個(gè)相關(guān)概念：第18頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的常用方法：化學(xué)法： 氯化鈣法物理法： 電擊法 顯微注射法 等第19頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 五、重組體的篩選與鑒定（篩）1. 抗生素抗性篩選2. 藍(lán)白篩選3. 限制性內(nèi)切酶法4. PCR法5. DNA測(cè)序法主要方法：第20頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 五、重組體的篩選與鑒定（篩）細(xì)胞在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)：無載體轉(zhuǎn)入的細(xì)胞dead；含有載體的細(xì)胞alive。1. 利用抗生素抗性標(biāo)志可篩選出帶有載體的重組子尚需進(jìn)一步鑒定載體是否

11、為含有目的DNA的重組載體第21頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四IPTGBlue-white screening of recombinants誘導(dǎo)物半乳糖苷酶Lac Operon ?在指示培養(yǎng)基上用顏色直接篩選重組克隆的方法五、重組體的篩選與鑒定（篩）2. 藍(lán)白篩選 第22頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 3. 限制性內(nèi)切酶法：根據(jù)限制酶切圖譜篩選特定DNA五、重組體的篩選與鑒定（篩）Linear vector (2700bp)insert (300bp) M 空質(zhì)粒 重組質(zhì)粒NcoIHindIII2700bp300bp提取陽(yáng)性克隆的重組DNA

12、RE消化電泳有無DNA片段的插入；插入片段的大小連接前用什么酶，就用什么酶切第23頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 可明確序列和閱讀框的正確性 5. 核苷酸序列測(cè)定是最準(zhǔn)確的鑒定目的DNA的方法 五、重組體的篩選與鑒定（篩）利用序列特異性引物，可鑒定陽(yáng)性克隆。如利用克隆位點(diǎn)兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，再結(jié)合序列分析，能可靠地證實(shí)插入片段的方向、序列和閱讀框的正確性。 4. PCR法：直接鑒定目的DNA的存在第24頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四基因克隆技術(shù)重組蛋白人源抗體重組多肽藥物重組疫苗基因克隆DNA序列測(cè)定重組載體基因治療載體RNA轉(zhuǎn)錄載體

13、打靶載體轉(zhuǎn)基因載體基因敲除動(dòng)物模型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型發(fā)夾RNARNAi核酸探針標(biāo)記分子雜交Southern blotNorthern blot構(gòu)建文庫(kù)基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)基因合成PCR-克隆-亞克隆基因突變基因克隆技術(shù)是分子生物學(xué)的核心技術(shù) 第25頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 克 隆 基 因 的 表 達(dá) 獲取重組蛋白重組子目的基因的mRNA表達(dá)蛋白質(zhì)第26頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四亞克?。⊿ub cloning）克隆載體表達(dá)載體第27頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四原核表達(dá)系統(tǒng)Prokaryotic express

14、ion systemEukaryotic expression system真核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌酵母昆蟲細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞Recombinant vectorpromoterTarget geneProteins Transformation/ Transfection 第28頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四原核表達(dá)系統(tǒng)： 外源基因引入原核細(xì)胞，使其快 速高效表達(dá)基因產(chǎn)物。真核表達(dá)系統(tǒng)： 外源基因引入真核細(xì)胞，使外源 基因在真核細(xì)胞中表達(dá)。表達(dá)體系 第29頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四第一部分.外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)原核細(xì)胞表達(dá)系

15、統(tǒng)組成二、原核表達(dá)載體一、原核宿主細(xì)胞第30頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 大腸桿菌（E.coli)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便, 快速、成本低 可高密度發(fā)酵培養(yǎng)20-30min12 hours6-8 Billion bacteriaOnce the recombinant system is established, it is cheap to manufacture.insulinRecombinant一、原核宿主細(xì)胞注意：用來克隆基因和表達(dá)基因的菌株不一樣，表達(dá)時(shí)，選用與表達(dá)載體相匹配的菌株。第31頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四生長(zhǎng)快，代謝易于控制，可

16、通過發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物。 基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于基因操作和分析。 多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。 生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚。 不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)象。 內(nèi)源蛋白酶會(huì)降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。 原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞具有如下的特點(diǎn)： 第32頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 二、原核表達(dá)載體在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。質(zhì)粒：噬菌體：最方便，最常用。長(zhǎng)片段原核表達(dá)質(zhì)粒第33頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 強(qiáng)啟動(dòng)子終止子SD序列1、原

17、核表達(dá)質(zhì)粒的元件：oriPT7SDMCSTerminatorProkaryotic Expression Plasmid Prokaryotic promoterLac Istart piontAmpicillin resistance克隆元件：表達(dá)元件：復(fù)制原點(diǎn)插入位點(diǎn)篩選標(biāo)記第34頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四啟動(dòng)子終止子SDmRNA多肽鏈利用強(qiáng)啟動(dòng)子，增加蛋白質(zhì)的生物合成轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的主要限速步驟，因此，選擇強(qiáng)的、可調(diào)控啟動(dòng)子是組建一個(gè)高效表達(dá)載體首先要考慮的問題。 第35頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四原核表達(dá)載體的啟動(dòng)子都

18、是可誘導(dǎo)的, 目的是在需要目的蛋白的時(shí)候才表達(dá)它.最理想的可調(diào)控啟動(dòng)子應(yīng)該是：早期階段：?jiǎn)?dòng)子被阻遏當(dāng)細(xì)胞數(shù)目達(dá)到一定密度時(shí)：通過誘導(dǎo)使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始轉(zhuǎn)錄。 第36頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四Plac： 受Lac阻遏蛋白負(fù)調(diào)節(jié)， 受IPTG的誘導(dǎo)。PL啟動(dòng)子：噬菌體早期 左向啟動(dòng)子。 常用的 原核啟動(dòng)子 PR啟動(dòng)子：噬菌體早期 右向啟動(dòng)子。受噬菌體CI基因調(diào)控 第37頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 終止子： 強(qiáng)終止子、二聚體終止子轉(zhuǎn)錄過度的危害： 影響目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率 干擾基因載體的復(fù)制等生物學(xué)功能 增加受體細(xì)胞的

19、無效能量消耗 啟動(dòng)子終止子SDmRNA第38頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四成熟型融合型分泌型減少原核細(xì)胞對(duì)外源蛋白的降解天然完整蛋白融合蛋白分泌性蛋白2、原核表達(dá)質(zhì)粒的類型：第39頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 1）成熟型表達(dá)載體oripromoterSDMCSExpression vector特點(diǎn)：外源基因需攜帶ATG和TAA只表達(dá)目的基因編碼的氨基酸產(chǎn)生天然蛋白，容易被降解，因此產(chǎn)量小，也可能不穩(wěn)定。缺點(diǎn)!PForeign DNA 第40頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四2) 融合型表達(dá)載體載體1：.ATG ACG

20、TCA GAT. 載體2：.ATG NAC GTC AGA T. 載體3：ATG NNA CGT CAG AT.第一種情況：ATGATGNATGNATGNATGNNInsert siteInsert siteInsert site 第41頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四第二種情況： 表達(dá)載體含有一段編碼原核蛋白的基因順序，使表達(dá)的蛋白質(zhì)N端或C端帶著一小段原核多肽。 Protein of interest with a small additional peptide at N or C end.Fig. A schematic structure of fusion

21、protein2) 融合型表達(dá)載體第42頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四Most popular prokaryotic expression plasmid with his-tag. 融合型表達(dá)載體舉例第43頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四融合蛋白Ni-affinity chromatography if the fused is 6-hisNiNiHis-his-his-his-his-hisIonic bond His-tag Protein可以加入蛋白酶切位點(diǎn)His taqHis taqTAANcoI (ATG)EcoRIHindIII

22、離子鍵親和層析第44頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 外源蛋白以融合蛋白的形式表達(dá), 讀碼框架固定或可選擇特點(diǎn)： 小結(jié): 融合型表達(dá)載體表達(dá)效率高產(chǎn)物穩(wěn)定 易純化：利用融合原核多肽的特性 Fusion protein can be purified easily Can be made in large amounts.優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：非天然蛋白，需要表達(dá)后切除融合蛋白第45頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 3)分泌型表達(dá)載體 Secretion expression vectorsATG下游構(gòu)建了信號(hào)肽基因序列Secreted into mediu

23、m?(!)E.Coli can not do that第46頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四Cell wallCytoplasmic membraneGenome 分泌到細(xì)胞周間隙中的重組蛋白質(zhì)Recombinant protein the space between cell membrane and cell wall. 第47頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四The recombinant protein will be secreted into periplasm避免目的蛋白被細(xì)菌蛋白酶降解The high expression leve

24、l利于收集外源蛋白優(yōu)點(diǎn)：讀碼框架固定: The target gene does not need start codon because it uses the ATG of signal peptide.特點(diǎn)： 第48頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 Single colony50 ml LB medium for 5 hours. OD=0.6 induce foreign gene expression in host.transform recombinant plasmid into expression host cell (BL21DE3)轉(zhuǎn)化平板細(xì)菌處

25、于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)留種，然后1/100接種。轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌要與表達(dá)載體相 配套！三、外源基因在E.coli中的表達(dá)第49頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四IPTG addition IPTG Induction： adding IPTG to the culture if the vector uses Lac operon to regulate foreign gene expression.Quantity of target protein in cell, units 第50頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 Where your exp

26、ressed protein will be located? Inclusion bodies (insoluble) Cytoplasm (soluble)Secreted into periplasmatic space(soluble or insoluble) NothingRecombinant protein may be hydrolyzed by proteinasesresistant to proteinase hydrolysis that results in the high yield 第51頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 SDSPuri

27、fy and Identify the proteinWestern Blot Analysis問題：是不是所有基因都可以在E.coli中表達(dá)？第52頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四外源基因在原核細(xì)胞表達(dá)的必要條件：刪除內(nèi)含子和5非編碼區(qū)外源基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子和SD順序控制下維持正確開放閱讀框架（ORF）mRNA穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不被降解蛋白不需要翻譯后加工過程 第53頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四真核基因在E.coli中表達(dá)應(yīng)該如何構(gòu)建？（1）基因片段應(yīng)該來源于mRNA，因?yàn)镋.coli不能對(duì)基因進(jìn)行剪接。真核基因原核基因斷裂基因連

28、續(xù)基因采用RT-PCR法 第54頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四（2）盡量將密碼子改變成E.coli偏愛密碼子，如果有困難，可嘗試將基因5端前50個(gè)堿基變成偏愛密碼子。 E.Coli 核糖體蛋白質(zhì)的密碼子使用頻率：第55頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 Case 1. hIFN-2b的表達(dá)hIFN-2b的特點(diǎn)：1）一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用，不需要翻譯后加工2）經(jīng)過密碼子的改造可以在E.coli中高效表達(dá)第56頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四Case 2. HBsAg的表達(dá)HBsAg的特點(diǎn)：1）高度糖基化E.Coli沒有蛋白質(zhì)加工修

29、飾功能，即使表達(dá)出蛋白質(zhì)也不具備天然蛋白質(zhì)的功能。2）HBV是真核病毒，因此HBsAg基因含有E.coli的稀有密碼子。因此，到目前為止，HBsAg重組疫苗還是在真核CHO細(xì)胞或酵母中表達(dá)的。 第57頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢(shì)：1. 具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)2. 具翻譯后修飾系統(tǒng)，重組蛋白具有很好的活性3. 可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表達(dá)4. 基因治療、研究基因的功能等 原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)：1. 沒有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能識(shí)別、剪除內(nèi)含子 2. 缺乏翻譯后加工系統(tǒng)，不能對(duì)翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)一步修飾加工 第58頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星

30、期四 真核細(xì)胞酵母細(xì)胞昆蟲細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞酵母表達(dá)系統(tǒng)昆蟲表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)以獲得大量的有活性的蛋白為目的研究基因或其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能為目的第二部分.外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)YeastInsectMammalianEukaryotic Expression System第59頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 一、酵母表達(dá)系統(tǒng)系統(tǒng)組成： 酵母細(xì)胞 酵母質(zhì)粒表達(dá)載體比細(xì)菌菌落大而厚，菌落表面光滑濕潤(rùn)、粘稠、容易挑起，質(zhì)地、顏色均一，多為乳白色*低等真核單細(xì)胞生物，生長(zhǎng)快，可大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng), 成本較低。*可以進(jìn)行一定程度的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。1.酵母細(xì)胞：第60頁(yè)，

31、共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 大腸桿菌/酵母菌穿梭載體 ：1. 在E.coli中復(fù)制與篩選 *pUC ori , Ampr2. 在酵母細(xì)胞象細(xì)菌中質(zhì)粒一樣復(fù)制（2u origin）3. 在酵母細(xì)胞中表達(dá)外源基因 *酵母可識(shí)別的啟動(dòng)子4. 篩選標(biāo)記： 營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選 URA32. 酵母質(zhì)粒表達(dá)載體第61頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 二、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)昆蟲病毒：baculovirus轉(zhuǎn)遞質(zhì)粒載體1、可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后加工修飾2、可高水平表達(dá)外源基因產(chǎn)物3、操作相對(duì)簡(jiǎn)單已經(jīng)商品化4、蛋白準(zhǔn)確定位如分泌到膜外。載體：昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的組分：昆蟲細(xì)胞 優(yōu)點(diǎn)：

32、第62頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四病毒基因組相對(duì)較大，不宜直接將外源基因克隆到病毒基因組。 the polyhedrin gene becomes unnecessary. replace polyhedrin coding seq with gene of interest (G of I)Baculovirus genomestrong PromoterPolyhedrin gene昆蟲病毒昆蟲表達(dá)載體：提供目的基因的質(zhì)粒載體昆蟲桿狀病毒. 第63頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 *首先將外源片段克隆到某質(zhì)粒上，再以某種機(jī)制將外源片段遞到

33、病毒基因組上有兩種不同原理構(gòu)建的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)：1）根據(jù)同源重組原理構(gòu)建的2）根據(jù)轉(zhuǎn)座子原理構(gòu)建的，如Bac-To-Bac表達(dá)系統(tǒng)昆蟲表達(dá)載體：提供目的基因的質(zhì)粒載體第64頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 -轉(zhuǎn)座子機(jī)制：如Bac-To-Bac表達(dá)系統(tǒng)Bacmid - insect cellBacmidPolyhedrin promoter將轉(zhuǎn)座子的靶點(diǎn)構(gòu)建到昆蟲病毒基因組上（Baculovirus plasmid） 帶有桿狀病毒基因組的質(zhì)粒，可在細(xì)菌和昆蟲細(xì)胞之間穿梭 第65頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 是否還記得轉(zhuǎn)座子是在染色體間運(yùn)動(dòng)？轉(zhuǎn)座子

34、(trans-poson,Tn)是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位?？稍诩?xì)菌的染色體，質(zhì)?；蚴删w之間自行移動(dòng)的遺傳成分，是基因組中一段特異的具有轉(zhuǎn)位特性的獨(dú)立的DNA序列。 第66頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 *將轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)臂構(gòu)建到MCS兩側(cè)。1.構(gòu)建重組轉(zhuǎn)遞質(zhì)粒*通過基因克隆的方法將外源片段克隆到轉(zhuǎn)遞質(zhì)粒上。慶大Ppolh真核篩選標(biāo)記基因 promoter of Polyhedrin G of I are flanked with two arms of a transposon.第67頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 2

35、 Recombinant bacmid DNA主要是LacZ , Kanr , oriE Baculovirus genome pFastBac1Tn7LPpolhForeign geneAttachment sitehelperCompetent DN10Bac E.coliTransformationhelperForeign genePpolhE.coli containing recombinant BacmidPpolhMini-prep of high molecular weight DNA2. To construct recombinant Bacmid DNA based

36、on transposition mechanism in E.coli.1 Recombinant donor plasmidHelper質(zhì)粒編碼轉(zhuǎn)座酶TetramprTn7RTet Kan , 慶大 Blue-White selection 慶大Transposition Bacmid（23天）第68頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四Isolated recombinant bacmid DNAthen transfect insect cells with lipo-insect4. Viral amplyfication: harvest the supernat

37、ant and infect insect cells for 5times5. recombinant protein: Expressed by insect cells is in supernantant while viral amplificates. 3. Bacmid will be packaged into viral particle in insect cell. Reconbinant baculoverus particle is released into the supernatant. Infect other cell.Recombinant bacmid

38、particles 第69頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四感染前感染后 第70頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四三、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)系統(tǒng)組成：宿主細(xì)胞：哺乳動(dòng)物細(xì)胞* 表達(dá)最接近天然的重組蛋白質(zhì)* 重組蛋白的產(chǎn)量較低* 直接利用宿主細(xì)胞研究重組蛋白的功能* 可用于基因治療表達(dá)載體：* 哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)粒表達(dá)載體* 動(dòng)物病毒 第71頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)粒表達(dá)載體eukaryoticMCSPoly A signalterminatorNeor第72頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)13分，星期四 酵母細(xì)胞昆蟲細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)粒昆蟲桿狀病毒質(zhì)?；虿《局亟M蛋白質(zhì)產(chǎn)物:產(chǎn)率翻譯后修飾活性載體目的基因優(yōu)選cDNA 真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的比較 Yeast system limited post-translational modifications grow readily in simple medium第73頁(yè)，共83頁(yè)，2022年，5月20