抗體制藥-課件

1、 抗體制藥 抗體制藥第一節(jié) 概述 1890年Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素,建立了血清療法,開(kāi)創(chuàng)了抗體制藥。 1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、球蛋白，并證明抗體活性主要存在于球蛋白組分?？贵w制藥第一節(jié) 概述 1890年Behring和北里柴三郎發(fā) 抗體是指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。 抗體的產(chǎn)生：機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞被活化增殖和分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。抗體制藥 抗體是指能與相應(yīng)抗抗體制藥抗體攻擊病毒抗體攻擊病毒凝集細(xì)菌凝集細(xì)菌 免疫球蛋白的發(fā)現(xiàn) 20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞癌變形成的惡性增殖性疾病

2、。病人血清中出現(xiàn)同抗體結(jié)構(gòu)類似的球蛋白，統(tǒng)稱為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)的概念，而抗體是生物學(xué)功能的概念。所有抗體是Ig，但并非所有Ig分子都有抗體活性?？贵w制藥 免疫球蛋白的發(fā)現(xiàn)抗體制藥注射抗原 IgM IgG（10d，IgM）抗體制藥初級(jí)免疫反應(yīng)5類在結(jié)構(gòu)和功能上不同的Ig由長(zhǎng)壽的T細(xì)胞和B細(xì)胞記憶IgA：唾液、肺、腸道等的分泌液。IgE：存在于已結(jié)合抗原的組織中。IgD：成熟的B淋巴細(xì)胞表面。注射抗原 IgM IgG（10d，IgM）抗體制 至2000年底，在美國(guó)藥品市場(chǎng)上生物技術(shù)藥物 有76種，其中抗體藥物有15種。 2019年治療用單抗銷售總

3、額已超過(guò)52億美元。 2019年約有50-60個(gè)治療性單抗上市。 2019年預(yù)計(jì)單抗銷售額200億美元。 美國(guó)已占全球單抗市場(chǎng)90%一支獨(dú)秀。 完全人源化單抗現(xiàn)有多個(gè)處于臨床前階段?？贵w制藥抗體藥物 至2000年底，在美國(guó)藥品市場(chǎng)上生物技術(shù)藥物 抗體制藥抗Antigenic determinant抗原決定基（簇） 一個(gè)抗原分子上可能有數(shù)個(gè)抗原決定基 每個(gè)抗原決定基至少誘生一種專一性抗體 蛋白質(zhì)性抗原決定基：含有六個(gè)以上氨基酸Antigenic determinant抗原決定基（簇）整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù) 基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小

4、型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫(kù)技術(shù) 噬菌體抗體庫(kù)技術(shù) Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達(dá)技術(shù)抗體制藥整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù) 基因工程抗體生成技 多克隆抗體（polyclonal antibody） 指由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如:免疫血清（含多種特異性抗體）。 實(shí)際意義： （1）預(yù)防、治療感染性疾病如：破傷風(fēng)抗毒素血清 抗破傷風(fēng)； 胎盤球蛋白 抗病毒感染等； 副作用： 超敏反應(yīng) （2）臨床診斷如：肥達(dá)氏反應(yīng)傷寒、副傷寒缺點(diǎn)：特異性差，易出現(xiàn)非特異性交叉反應(yīng)。 抗體制藥 多克隆抗體（polyclonal antibody）超敏反應(yīng)（hyp

5、ersensitivity ） 異常的、過(guò)高的免疫應(yīng)答。即機(jī)體與抗原性物質(zhì)在一定條件下相互作用，產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞或特異性抗體，如與再次進(jìn)入的抗原結(jié)合，可導(dǎo)致機(jī)體生理功能紊亂和組織損害的免疫病理反應(yīng)，又稱變態(tài)反應(yīng)。引起超敏反應(yīng)的抗原性物質(zhì)可以是完全抗原（異種動(dòng)物血清、組織細(xì)胞、微生物、寄生蟲(chóng)、植物花粉、獸類皮毛等），也可以是半抗原（如青霉素、磺胺、非那西汀等藥物，或生漆等低分子物質(zhì)）。超敏反應(yīng)（hypersensitivity ） 異常的各種類型的超敏反應(yīng)型超敏反應(yīng)：主要疾病有：全身性過(guò)敏反應(yīng)、皮膚超敏反應(yīng)、消化道超敏反應(yīng)、呼吸道超敏反應(yīng)。型超敏反應(yīng)：主要引起的疾病有：輸血反應(yīng)、新生兒溶血癥、免

6、疫性血細(xì)胞減少癥。超敏反應(yīng)：引起的疾病有:血清病、感染后腎小球腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過(guò)敏性休克樣反應(yīng)、毛細(xì)支氣管炎。超敏反應(yīng)：主要臨床疾病有結(jié)核菌素反應(yīng)、傳染性超敏反應(yīng)、接觸性皮炎、移植排斥反應(yīng)各種類型的超敏反應(yīng)型超敏反應(yīng)：主要疾病有：全身性過(guò)敏反應(yīng)、傳統(tǒng)抗血清抗 原免 疫所有抗體混合123412341234脾 臟淋巴結(jié)B 細(xì)胞傳統(tǒng)抗血清抗 原免 疫所有抗體混合123412341234脾 抗體-a-b-c-d-a -b -c -d抗原決定基BALB/cabbcd傳統(tǒng)抗體 (抗血清) 是所有抗體的混和 脾臟產(chǎn)生各種 B 細(xì)胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫 抗原采血后可得傳統(tǒng)抗血清已

7、建立之小鼠骨髓癌細(xì)胞株由脾臟收集 B 細(xì)胞抗原通常有多個(gè)抗原決定基免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射五到八次Ag X 抗體-a-b-c-d-a -b - 傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒(méi)有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-? 1 2 3 Ag A x y z Ag B 1 2 0 Ag A123123123 傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒(méi)有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-? 1 單克隆抗體的特點(diǎn)高度特異性均一性來(lái)源穩(wěn)定可大量生產(chǎn) 抗體制藥 1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）。 單克隆抗體的特點(diǎn)抗體制藥 1975年可生產(chǎn)有用抗體的 淋

8、巴細(xì)胞 若與 癌細(xì)胞融合，則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細(xì)胞株。癌細(xì)胞可培養(yǎng)生長(zhǎng)漿細(xì)胞B cell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細(xì)胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長(zhǎng)產(chǎn)生專一性抗體一個(gè) B cell 只產(chǎn)生一種抗體可生產(chǎn)有用抗體的 淋巴細(xì)胞 若與 癌細(xì)胞融合，則形成穩(wěn)定而可 一個(gè) B 細(xì)胞只能生產(chǎn)一種抗體，對(duì)付某一 抗原決定基。 若有許多抗原決定基，則需許多株 B 細(xì)胞分別生產(chǎn)許多抗體。BBBYYYY抗 原BYB親和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基 一個(gè) B 細(xì)胞只能生產(chǎn)一種抗體，對(duì)付某一 抗原決定基1234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+

9、癌細(xì)胞各抗體分開(kāi)單克隆抗體1234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+各抗 單克隆抗體的應(yīng)用作為抗體制劑，用于疾病的診斷和治療。檢測(cè)與某些疾病有關(guān)的抗原，輔助臨床診斷。放射性核素標(biāo)記單抗進(jìn)行腫瘤顯像，做免疫定位診斷。CD3單抗作為免疫抑制劑對(duì)器官移植免疫排斥有抑制作用。以單克隆抗體作為載體的藥物對(duì)腫瘤進(jìn)行定向治療?？贵w制藥 單克隆抗體的應(yīng)用抗體制藥McAb在免疫導(dǎo)向療法中存在的問(wèn)題 A、McAb均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗 體（HAMA），加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)的半衰期只有56h，維持有效藥物作用靶組織時(shí)間； B、完整的抗體分子的相對(duì)分子質(zhì)量過(guò)大，難以穿透實(shí)體腫瘤組

10、織，達(dá)不到有效的治療濃度。需要解決的問(wèn)題 A、降低McAb的免疫源性； B、降低McAb的相對(duì)分子質(zhì)量。解決問(wèn)題的方法或途徑基因工程技術(shù) 1984年報(bào)道了人鼠嵌合抗體，之后制備出了改型抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識(shí)別單位等多種類型，基本上消除了抗體的鼠源性（免疫源性），相對(duì)分子質(zhì)量只有完整抗體分子的1/801/3。單克隆抗體McAb在免疫導(dǎo)向療法中存在的問(wèn)題單克隆抗體第二節(jié) 單克隆抗體 單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無(wú)限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過(guò)有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的。由于這種抗體是針對(duì)一個(gè)抗原決定族的抗體，又是單一的B 淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，故稱

11、為單克隆抗體?？贵w制藥第二節(jié) 單克隆抗體 單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有抗體制藥抗體制藥抗體制藥抗體制藥-d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgXAgXHATPEG Cell fusionHybridoma cells 融合瘤細(xì)胞（Subcloning） (確定只有一種細(xì)胞)ddabcdabcd+-X-d-c-b-a+-dNS-1骨髓癌細(xì)胞B cell脾細(xì)胞分株培養(yǎng)篩選篩選單抗傳統(tǒng)抗體 (抗血清)試驗(yàn)專一性對(duì)抗原的反應(yīng)無(wú)法分辨完全不同d舊有抗原d新的抗原-d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgAgHATPEG C 一、抗原與動(dòng)物免疫 制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當(dāng)抗原，再用抗原進(jìn)行動(dòng)物免

12、疫。 為使雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定，免疫動(dòng)物和骨髓瘤細(xì)胞供體同一品系動(dòng)物進(jìn)行免疫。 單克隆抗體 一、抗原與動(dòng)物免疫單克隆抗體 抗原與動(dòng)物免疫免疫方法：體內(nèi)免疫和體外免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原骨髓瘤細(xì)胞系：來(lái)自BALB/c小鼠和 Lou大鼠免疫動(dòng)物：BALB/c小鼠和Lou大鼠單克隆抗體白化小鼠原種，命名為BALB/c品系。1985年我國(guó)從美國(guó)引進(jìn)到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，為BALB/c第180代。毛色：白化。主要特性：乳腺腫瘤自然發(fā)生率低。易患慢性肺炎。對(duì)放射線甚為敏感。與其他近交系相比，肝、脾與體重的比值較大。有自發(fā)高血壓癥，老年鼠心臟有病變，雌雄鼠均有動(dòng)脈硬化。對(duì)鼠傷寒沙門氏菌補(bǔ)體敏感，

13、對(duì)麻疹病毒中度敏感。對(duì)利什曼原蟲(chóng)屬、立克次氏體和百日咳組織胺易感因子敏感。主要用途：廣泛地應(yīng)用于腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、核醫(yī)學(xué)研究，以及單克隆抗體的制備等。BALB/c小鼠 抗原與動(dòng)物免疫單克隆抗體白化小鼠原種， 體內(nèi)免疫法 適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多時(shí)應(yīng)用，一般用812周齡雌性鼠。 顆粒性抗原（如細(xì)菌細(xì)胞抗原）的免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔107個(gè)細(xì)胞進(jìn)行初次免疫，間隔13周，再追加免疫12次。 可溶性抗原按每只小鼠10100g抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行初次免疫，間隔24周，再用不加佐劑原抗原追加免疫12次。一般再采脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最后一次抗原。刺激B細(xì)胞分

14、裂。單克隆抗體 體內(nèi)免疫法單克隆抗體 脾內(nèi)免疫法即在麻醉下直接將 0.10.2ml抗原注入脾臟進(jìn)行免疫。細(xì)胞抗原需105個(gè)，可溶性抗原需10g。體內(nèi)免疫 脾內(nèi)免疫法即在麻醉下直接將體內(nèi)免疫 體外免疫法 用于不能采用體內(nèi)免疫的情況下，如制備人源性McAb；免疫源性極弱，易引起免疫抑制。 優(yōu)點(diǎn)：需抗源量少，免疫期短，干擾因素少。 操作：用48周齡BALB/c小鼠的脾臟制成單細(xì) 胞懸液，再加入適當(dāng)抗原使其濃度達(dá)0.5 5g/ml, 在5% CO2、37 下培養(yǎng)4 5天, 再分離脾細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞融合。體外免疫 體外免疫法體外免疫二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合的方法 脾細(xì)胞（1108） 骨髓

15、瘤細(xì)胞（2107） 混合 PEG(2min) 融合 培養(yǎng)液稀釋融合液抗體制藥聚乙二醇（PEG）：融合劑，相對(duì)分子量4000，濃度為50%。二甲基亞砜（DMSO）：促融劑，增加融合率。二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)抗體制藥聚乙二醇（PEG）融合率高自身不分泌抗體產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體能力強(qiáng)長(zhǎng)期穩(wěn)定細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞的特點(diǎn)融合率高細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞的特點(diǎn) 雜交瘤細(xì)胞的篩選 細(xì)胞融合后可產(chǎn)生多種融合細(xì)胞：脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合細(xì)胞。 利用HAT選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行淘汰： 次氨甲喋呤（ A ）阻斷DNA合成，淘汰瘤-瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、脾-脾細(xì)胞、脾細(xì)胞；而脾細(xì)胞可利用次黃嘌呤（ H ）和胸腺嘧啶（

16、 T ）合成DNA，使脾-瘤融合細(xì)胞得以生長(zhǎng)。細(xì)胞融合 雜交瘤細(xì)胞的篩選細(xì)胞融合細(xì)胞融合細(xì)胞融合 三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化 常用檢測(cè)方法免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù)放射免疫技術(shù)單克隆抗體 三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化單克隆抗體 克隆化是指單個(gè)細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程。 常用的克隆化方法有限稀釋法：把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到96孔 板，使每孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞。 第一次克隆化時(shí)也要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以 后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培 養(yǎng)液。軟瓊脂法：在培養(yǎng)液中加入0.5%的瓊脂糖凝膠，細(xì)胞 分裂后形成小球樣團(tuán)塊，由于培養(yǎng)基是半 固體狀態(tài)，可用吸管吸出，移入96孔板

17、培 養(yǎng)。單克隆抗體 克隆化是指單個(gè)細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選單克隆抗體ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選單克隆抗體 四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 雜交瘤細(xì)胞鑒定染色體分析正常鼠的脾細(xì)胞染色體數(shù)：40，全部為端著絲粒。小鼠骨髓瘤細(xì)胞染色體：SP2/0細(xì)胞為6268，NS-1為 5464， 大多數(shù)為非整倍性，有中部和亞中 部著絲點(diǎn)。雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目：接近兩親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和， 在結(jié)構(gòu)上多數(shù)為端著絲粒染色體外， 還應(yīng)出現(xiàn)少數(shù)標(biāo)志染色體。 染色體數(shù)目多且較集中的雜交瘤細(xì)胞分泌高效價(jià) 的抗體；反之，則反。單克隆抗體 四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 單克隆

18、抗體 五、單克隆抗體的大量制備體外培養(yǎng)法：可獲的10g/ml抗體體內(nèi)誘生法：可獲的520mg/ml抗體 降植烷 BALB/c小鼠 接種雜交瘤細(xì)胞 取腹水 離心 上清液?jiǎn)慰寺】贵w 五、單克隆抗體的大量制備單克隆抗體 六、單克隆抗體的純化 根據(jù)Ig的類和亞類以及用途選擇不同的純化方法。體外診斷試劑IgG類沉淀處理+親和層析IgM類沉淀處理+凝膠過(guò)濾體內(nèi)診斷試劑或治療用藥親和層析+陰離子交 換層析。注意除去毒 素、病毒、核酸等微 量的污染物。單克隆抗體 六、單克隆抗體的純化單克隆抗體動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備的McAb純化的一般程序 （1）澄清和沉淀處理： 1000g 離心5min，去除沉淀物（紅細(xì)胞、細(xì)胞

19、碎塊、纖維蛋白凝塊和脂質(zhì)） 20 000g 高速離心30min ,去除殘留的小顆粒物質(zhì) 用0.2 m微孔濾膜過(guò)濾，去除細(xì)菌、支原體 飽和硫酸銨沉淀抗體（50%飽和硫酸銨能回收90%以上的抗體）。單抗純化動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備的McAb純化的一般程序單抗純化 動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備的McAb純化的一般程序 （2）分離 A、凝膠過(guò)濾：用于IgG和IgM類。常用SephadexG200 為分離介質(zhì)，收集到3個(gè)峰，最高峰為IgM，另外兩個(gè)峰為 IgG?？贵w回收率達(dá)5080%，能去除微量雜蛋白，純度達(dá)95%以上。 B、陰粒子交換層析：用于IgG類。在pH7.4條件下，IgG1和IgG2能結(jié)合在DEAE填料上，其

20、中IgG2a可在較低粒子強(qiáng)度下洗脫下來(lái)，其純度很高。 IgG2b和IgG3在低離子強(qiáng)度下易發(fā)生沉淀，可增加離子強(qiáng)度以提高產(chǎn)量，但其純度相對(duì)較低。 C、親和層析：多用蛋白A親和層析，適用于IgG類。鼠源性單抗在 pH8.0時(shí)，IgG2b、IgG3幾乎全部結(jié)合在蛋白 A柱上， IgG1稍差，用 pH3.5緩沖液可洗脫 IgG2b，pH4.0緩沖液可洗脫下IgG3，pH4.5緩沖液可洗脫IgG2a， pH6.0可洗脫IgG1。收獲的抗體純度很高，但也有極微量的雜蛋白。單抗純化 動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備的McAb純化的一般程序單抗純第三節(jié) 鼠源性單克隆抗體的改造 雜交瘤單抗為鼠源性，應(yīng)用人體產(chǎn)生人抗鼠抗體及

21、毒副作用。對(duì)鼠源性的單抗進(jìn)行基因加工和改造。 目的：降低免疫原性；降低相對(duì)分子量，增加組織通透性。單抗改造第三節(jié) 鼠源性單克隆抗體的改造 雜交瘤單抗Ig分子結(jié)構(gòu)單抗改造原理：抗體同抗原結(jié)合的功能決定于抗體分子的可變區(qū)（V），同種性免疫原性則決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)（C）。Ig分子結(jié)構(gòu)單抗改造原理：抗體同抗原結(jié)抗體制藥-課件1個(gè)Fab片段1個(gè)Fc片段1個(gè)Fab片段1個(gè)Fc片段Ig分子的基因結(jié)構(gòu)單抗改造Ig分子的基因結(jié)構(gòu)單抗改造單抗改造單抗改造一、人鼠嵌合抗體（chimeric antibody） 在基因水平上將鼠源單抗的可變區(qū)（V）與人抗體的穩(wěn)定區(qū)（C）融合而得到的抗體。單抗改造一、人鼠嵌合抗體（

22、chimeric antibody） 構(gòu)建嵌合抗體的大致過(guò)程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來(lái)，連到包含有人抗體穩(wěn)定區(qū)基因及表達(dá)所需的其它元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等)的表達(dá)載體上，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞)中表達(dá)。單抗改造構(gòu)建重組表達(dá)載體 構(gòu)建嵌合抗體的大致過(guò)程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因 克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從基因組文庫(kù)中分離，也可用PCR技術(shù)分離。 人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇，不同的恒定區(qū)會(huì)帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用，可通過(guò)點(diǎn)突變來(lái)修飾調(diào)整其效應(yīng)。 人-鼠嵌合抗體與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人體內(nèi)應(yīng)用，加強(qiáng)ADCC效應(yīng)

23、。目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關(guān)抗原)的嵌合抗體。單抗改造 克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從基因組文庫(kù)中分離，也可用ADCC效應(yīng) 即抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。其機(jī)制為靶細(xì)胞膜抗原與特異性IgG類抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物后，IgG抗體的Fc段與效應(yīng)細(xì)胞(如NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)上的Fc受體結(jié)合，使效應(yīng)細(xì)胞活化，產(chǎn)生對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。 單抗改造ADCC效應(yīng) 即抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。鼠單抗可變區(qū)的人源化 盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時(shí)它仍可能引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術(shù)。 CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)

24、，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。單抗改造鼠單抗可變區(qū)的人源化 盡管嵌合抗體的免疫原性已降低二、改形抗體（CDR移植抗體） ( Reshaping antibody ) Ig 分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR區(qū)），而不是整個(gè)可變區(qū)。H和L鏈各有三個(gè)CDR，其它部分稱框架區(qū)。 用鼠源單抗的CDR序列替換人Ig 分子中CDR序列，則可使人的Ig 分子具有鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性?？上庖咴葱?。單抗改造CDR區(qū)二、改形抗體（CDR移植抗體） ( Reshaping a單抗改造單抗改造三、小分子抗體 基因工程小分子抗體僅表達(dá)鼠源單抗的V區(qū)

25、片段，相對(duì)分子量為原抗體的1/801/3。即保留CDR區(qū)，而Ig 分子中的C區(qū)不表達(dá)。 小分子抗體類型有 Fab片段抗體： VH+CH1 Fv抗體： VH+VL 單鏈抗體： VH-Linker-VL 單域抗體：VH或VL 最小識(shí)別單位（MRU）單抗改造三、小分子抗體 基因工程小分子抗體僅表達(dá)鼠源單抗的V小分子抗體的優(yōu)點(diǎn)可以用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低;分子小，穿透力強(qiáng);不含F(xiàn)c，沒(méi)有Fc帶來(lái)的效應(yīng);在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等。單抗改造小分子抗體的優(yōu)點(diǎn)單抗改造FvScFv單區(qū)抗體最小識(shí)別單位Fab小分子抗體FvScFv單區(qū)抗體最

26、小識(shí)別單位Fab小分子抗體 由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。 把Fab與細(xì)菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽作用下，F(xiàn)ab進(jìn)入質(zhì)周腔，裝配折疊后具有結(jié)合抗原的活性。（1）Fab （VH+CH1 ）小分子抗體 由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。 Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。（2）Fv（VH+VL）或 ScFv FvScFv連接肽小分子抗體 Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。（2 Fv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。 在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體。 連接肽的長(zhǎng)度在10-15個(gè)氨基酸左

27、右，不宜太長(zhǎng)或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點(diǎn)。常用的連接肽是(GGGGS)3。小分子抗體 Fv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合，故Fv不單鏈抗體大多在大腸桿菌中表達(dá)直接在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；與其它菌體融合表達(dá)融合蛋白；分泌表達(dá)具有功能的單鏈抗體。小分子抗體 單鏈抗體大多在大腸桿菌中表達(dá)小分子抗體 即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。 （3）單域抗體（VH或VL ）VH小分子抗體 即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu) 約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個(gè)CDR構(gòu)成，

28、它也保持著抗體的特異性。（4）最小識(shí)別單位（MRU）CDR小分子抗體 約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個(gè)CD四、雙功能抗體 即雙特異性抗體（BsAb）。它是一種非天然性抗體。其結(jié)合抗原的兩個(gè)臂具有不同的特異性。乃是一種小分子的雙價(jià)雙特異性抗體片段。 單抗改造四、雙功能抗體 即雙特異性抗體（BsAb）。它是一種 雙特異性抗體是指能同時(shí)識(shí)別2種抗原的抗體。1種為對(duì)應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原，另1種為對(duì)應(yīng)效應(yīng)成分。 即能結(jié)合靶腫瘤細(xì)胞又能結(jié)合高細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞富集在腫瘤周圍，而且可以模擬天然配體的作用,與細(xì)胞表面引發(fā)分子結(jié)合，激活效應(yīng)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷和裂解。雙功能抗體 雙特

29、異性抗體是指能同時(shí)識(shí)別2種抗原的抗體。1種為 雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比，除了能特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞外，還能將循環(huán)血液中的免疫效應(yīng)細(xì)胞再導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞處，從而使效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性增強(qiáng)，發(fā)揮免疫導(dǎo)向作用，這是腫瘤治療的新突破。雙功能抗體 雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比，除了能特異性雙功能抗體多價(jià)小分子抗體雙功能抗體多價(jià)小分子抗體五、抗體融合蛋白 從廣義講應(yīng)屬于雙功能抗體范疇。類型：（1）配基配基型融合蛋白，如 CD4-Fc （2）配基Ig型嵌合抗體，如 IL-2-Ig（3）配基FV型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3（4）受體FV型融合蛋白（5）酶抗體型融合蛋白（abeneyme，抗體

30、酶）單抗改造五、抗體融合蛋白 從廣義講應(yīng)屬于雙功能抗體范疇。類型：?jiǎn)蔚谒墓?jié) 基因工程抗體和抗體工程 抗體研究的三個(gè)階段：以1890年Behring發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素為代表，其特點(diǎn)是用抗原免疫動(dòng)物來(lái)獲得多克隆抗體；以1975年Khler創(chuàng)建雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體為代表；以1994年Winter以基因工程方法制備抗體為代表。通過(guò)細(xì)菌發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)抗體，在此基礎(chǔ)上發(fā)展成抗體工程。他創(chuàng)建了噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，克服了人體不能隨意免疫的缺點(diǎn)，用人外周血制備抗體文庫(kù)，從而獲得人源性基因工程抗體?？贵w制藥第四節(jié) 基因工程抗體和抗體工程 抗體研究的三個(gè)階段抗體庫(kù)技術(shù) 抗體庫(kù)技術(shù)是用基因工程方

31、法把人或其他動(dòng)物的全部抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因克隆出來(lái)，在原核載體上表達(dá)，然后篩選出所需的特異基因和抗體。抗體工程抗體庫(kù)技術(shù) 抗體庫(kù)技術(shù)是用基因工程方法把人或其他動(dòng)一、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本方法1.獲取目的基因 提取RNA，經(jīng)RT-PCR獲取抗體某一特定基因區(qū)段。2.抗體庫(kù)技術(shù)的載體 普遍使用噬菌粒（phagemid）載體。3.淘篩（panning） 用固相化抗原對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的載體進(jìn)行淘篩，淘汰非目的克隆，使目的克隆大量擴(kuò)增。4.表達(dá)與鑒定 目的克隆經(jīng)過(guò)鑒定后，再導(dǎo)入感受態(tài)菌株，進(jìn)行可溶性表達(dá)，其產(chǎn)物用Western blot分析確定后，就完成了全過(guò)程?？贵w工程一、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本方法1.

32、獲取目的基因抗體工程RT-PCR 將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)?？贵w工程反轉(zhuǎn)錄酶RNA cDNA 擴(kuò)增目的片段 PCRRT-PCR 將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的抗體制藥-課件噬菌體抗體庫(kù)的“吸附一洗脫一擴(kuò)增”富集性選擇過(guò)程噬菌體抗體庫(kù)的“吸附一洗脫一擴(kuò)增”富集性選擇過(guò)程二、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的特點(diǎn)1.模擬天然全套抗體庫(kù) 抗體文庫(kù)可以達(dá)到或超過(guò)1011庫(kù)容，能包含B細(xì)胞全部克隆。建庫(kù)的外源基因來(lái)自人體外周血、骨髓或脾臟的淋巴細(xì)胞提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA擴(kuò)增，是人體多克隆細(xì)胞的總mRNA。使用的通用引物采自多個(gè)人體，具有人的種屬普遍性。V

33、H和VL基因的隨機(jī)重組增加了抗體的多樣性。2.避開(kāi)了人工免疫和雜交瘤技術(shù) 由于抗體庫(kù)的大容量和極高的篩選效率，使得可以調(diào)出任意抗體基因，用基因工程方法制備抗體，因而能避免使用人工免疫動(dòng)物和細(xì)胞融合技術(shù)。3.可獲得高親和力的人源化抗體 在噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)中，VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過(guò)程，所用的抗體基因又來(lái)自人體，因此，所產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的人源化抗體?？贵w工程二、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的特點(diǎn)1.模擬天然全套抗體庫(kù)抗體工程三、基因工程抗體的表達(dá)1.原核細(xì)胞表達(dá)2.真核細(xì)胞表達(dá) 酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞、真菌等。3.轉(zhuǎn)基因植物表達(dá) 煙草葉和擬南芥植物。其產(chǎn)量可達(dá)葉片

34、總蛋白量的1.3%。4.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá) 單基因水平上做轉(zhuǎn)基因鼠。抗體工程三、基因工程抗體的表達(dá)1.原核細(xì)胞表達(dá)抗體工程第五節(jié) 抗體診斷試劑 抗原抗體特異性結(jié)合，在體內(nèi)和體外均可呈顯某種反應(yīng)。在體內(nèi)，可表現(xiàn)為溶菌、殺菌、促進(jìn)吞噬或中和毒素等作用，故抗體類藥物可用于治療。在體外，由于抗原性狀和反應(yīng)條件不同，可發(fā)生凝集或沉淀等可見(jiàn)反應(yīng)，故可用已知抗體來(lái)鑒定抗原；做病原學(xué)診斷和血型測(cè)定，稱為血清學(xué)鑒定?？贵w診斷藥物基本分為三類：血清學(xué)鑒定用的和免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體制劑，以及體內(nèi)導(dǎo)向診斷藥物?？贵w制藥第五節(jié) 抗體診斷試劑 抗原抗體特異性一、血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑1.鑒定病原菌用的抗體試劑（1）常用診斷

35、血清的品種和用途 見(jiàn)書 162頁(yè)表46?？贵w診斷試劑一、血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑1.鑒定病原菌用的抗體試劑抗體診1.鑒定病原菌用的抗體試劑（2）診斷血清的制備步驟a、制備細(xì)菌抗原 細(xì)菌接種培養(yǎng)收集菌苔制成菌液b、免疫動(dòng)物和制備抗體血清 動(dòng)物：家兔、馬、羊、豚鼠。 免疫途徑：靜脈、腹腔、皮下。 接種次數(shù)37次，每次間隔34d，末次注射后68d取血樣測(cè)效價(jià)，達(dá)到要求，即可采血，離心分離血清。c、診斷血清的診斷方法 直接凝集反應(yīng)。抗體診斷試劑豚鼠1.鑒定病原菌用的抗體試劑抗體診斷試劑豚鼠2.乙型肝炎病毒表面抗原的反向被動(dòng)血凝診斷試劑（1）試劑制備原理：紅細(xì)胞經(jīng)甲醛處理后，在酸性條件下能吸附蛋白質(zhì)，當(dāng)

36、純化的抗HBs血清吸附其上時(shí)便具有抗體活性，若待測(cè)樣品中存在有HBsAg時(shí)，則發(fā)生特異性結(jié)合而使血細(xì)胞發(fā)生凝集。（2）制備步驟：先用HBsAg免疫豚鼠獲得抗HBs血清硫酸銨鹽析/柱層析取其IgG在pH4.0醋酸緩沖液中致敏醛化血細(xì)胞洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀釋液稀釋至一定濃度，分裝即成。 （3）診斷方法：在V型血凝板上進(jìn)行，陰性樣品不凝集，許血細(xì)胞沉積于V型孔底部，呈尖點(diǎn)狀；陽(yáng)性樣品血細(xì)胞凝集成塊狀。單抗改造2.乙型肝炎病毒表面抗原的反向被動(dòng)血凝診斷試劑（1）試劑制3.妊娠診斷試劑 婦女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量增高，在3個(gè)月內(nèi)可達(dá)到高峰。此時(shí)檢測(cè)尿液中的HCG，就可確定是否懷

37、孕。單抗改造 HCG（人絨毛膜促性腺激素）是由胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，由a-和b-兩個(gè)亞單位構(gòu)成。 正常參考值妊娠周數(shù) HCG（IU/L） 1-2周 50-5002-3周 100-50003-4周 500-100004-5周 1000-500005-6周 10000-1000006-8周 15000-2000002-3月 10000-1000003.妊娠診斷試劑 婦女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量4.抗ABO血型系統(tǒng)血清單抗改造原理：血清學(xué)方法檢測(cè)ABO血型是根據(jù)抗原、抗體相互作用的原理，檢出能產(chǎn)生抗體的血型抗原。方法：向新鮮血液中加入抗A，抗B，抗O標(biāo)準(zhǔn)血清，離心、振蕩、靜置。細(xì)

38、胞沉積在底部（陽(yáng)性），不凝集孔細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)（陰性）。4.抗ABO血型系統(tǒng)血清單抗改造原理：血清學(xué)方法檢測(cè)ABO血二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑 給抗體標(biāo)記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應(yīng)放大，使常規(guī)不能觀察的反應(yīng)得以顯現(xiàn)，可對(duì)微量抗原進(jìn)行定性定量測(cè)定，靈敏度提高。結(jié)合顯微鏡技術(shù)，還可對(duì)抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的定位測(cè)定。除臨床診斷外，還能為探討發(fā)病機(jī)制提供手段?？贵w診斷試劑二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑 給抗體標(biāo)記放射性核1.熒光抗體診斷試劑 熒光抗體是用熒光色素，如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標(biāo)記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有

39、抗原物質(zhì)的組織切片或細(xì)胞，熒光抗體就與抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達(dá)到診斷和定位的目的。抗體診斷試劑二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑1.熒光抗體診斷試劑抗體診斷試劑二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試2.免疫酶抗體診斷試劑（酶標(biāo)診斷試劑） a、HBsAg（乙型肝炎表面抗原）酶標(biāo)診斷試劑 b、HBeAg（乙型肝炎e抗原）酶標(biāo)診斷試劑 c、HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶標(biāo)診斷試劑 d、測(cè)定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標(biāo)診斷試劑 e、AFP（甲胎蛋白）酶標(biāo)診斷試劑 f、CEA（癌胚抗原）酶標(biāo)診斷試劑抗體診斷試劑二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑2.免疫酶抗體診斷試劑（酶標(biāo)診斷試劑）抗體診斷試劑二、免疫標(biāo)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定原理 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay 簡(jiǎn)稱ELISA)是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques) 上發(fā)展起來(lái)的一種新型免疫測(cè)定技術(shù)，ELISA過(guò)程包