抗體制藥-課件

1、 抗體制藥 抗體制藥第一節(jié) 概述 1890年Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素,建立了血清療法,開創(chuàng)了抗體制藥。 1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、球蛋白，并證明抗體活性主要存在于球蛋白組分?？贵w制藥第一節(jié) 概述 1890年Behring和北里柴三郎發(fā) 抗體是指能與相應抗原特異性結合具有免疫功能的球蛋白。 抗體的產(chǎn)生：機體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細胞被活化增殖和分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的球蛋白?？贵w制藥 抗體是指能與相應抗抗體制藥抗體攻擊病毒抗體攻擊病毒凝集細菌凝集細菌 免疫球蛋白的發(fā)現(xiàn) 20世紀60年代發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤是漿細胞癌變形成的惡性增殖性疾病

2、。病人血清中出現(xiàn)同抗體結構類似的球蛋白，統(tǒng)稱為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化學結構的概念，而抗體是生物學功能的概念。所有抗體是Ig，但并非所有Ig分子都有抗體活性。抗體制藥 免疫球蛋白的發(fā)現(xiàn)抗體制藥注射抗原 IgM IgG（10d，IgM）抗體制藥初級免疫反應5類在結構和功能上不同的Ig由長壽的T細胞和B細胞記憶IgA：唾液、肺、腸道等的分泌液。IgE：存在于已結合抗原的組織中。IgD：成熟的B淋巴細胞表面。注射抗原 IgM IgG（10d，IgM）抗體制 至2000年底，在美國藥品市場上生物技術藥物 有76種，其中抗體藥物有15種。 2019年治療用單抗銷售總

3、額已超過52億美元。 2019年約有50-60個治療性單抗上市。 2019年預計單抗銷售額200億美元。 美國已占全球單抗市場90%一支獨秀。 完全人源化單抗現(xiàn)有多個處于臨床前階段?？贵w制藥抗體藥物 至2000年底，在美國藥品市場上生物技術藥物 抗體制藥抗Antigenic determinant抗原決定基（簇） 一個抗原分子上可能有數(shù)個抗原決定基 每個抗原決定基至少誘生一種專一性抗體 蛋白質性抗原決定基：含有六個以上氨基酸Antigenic determinant抗原決定基（簇）整體水平抗體生成技術細胞工程抗體生成技術 基因工程抗體生成技術多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小

4、型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術 噬菌體抗體庫技術 Ig基因轉基因小鼠抗體真核表達技術抗體制藥整體水平抗體生成技術細胞工程抗體生成技術 基因工程抗體生成技 多克隆抗體（polyclonal antibody） 指由不同B細胞克隆產(chǎn)生的針對抗原物質中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如:免疫血清（含多種特異性抗體）。 實際意義： （1）預防、治療感染性疾病如：破傷風抗毒素血清 抗破傷風； 胎盤球蛋白 抗病毒感染等； 副作用： 超敏反應 （2）臨床診斷如：肥達氏反應傷寒、副傷寒缺點：特異性差，易出現(xiàn)非特異性交叉反應。 抗體制藥 多克隆抗體（polyclonal antibody）超敏反應（hyp

5、ersensitivity ） 異常的、過高的免疫應答。即機體與抗原性物質在一定條件下相互作用，產(chǎn)生致敏淋巴細胞或特異性抗體，如與再次進入的抗原結合，可導致機體生理功能紊亂和組織損害的免疫病理反應，又稱變態(tài)反應。引起超敏反應的抗原性物質可以是完全抗原（異種動物血清、組織細胞、微生物、寄生蟲、植物花粉、獸類皮毛等），也可以是半抗原（如青霉素、磺胺、非那西汀等藥物，或生漆等低分子物質）。超敏反應（hypersensitivity ） 異常的各種類型的超敏反應型超敏反應：主要疾病有：全身性過敏反應、皮膚超敏反應、消化道超敏反應、呼吸道超敏反應。型超敏反應：主要引起的疾病有：輸血反應、新生兒溶血癥、免

6、疫性血細胞減少癥。超敏反應：引起的疾病有:血清病、感染后腎小球腎炎、類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過敏性休克樣反應、毛細支氣管炎。超敏反應：主要臨床疾病有結核菌素反應、傳染性超敏反應、接觸性皮炎、移植排斥反應各種類型的超敏反應型超敏反應：主要疾病有：全身性過敏反應、傳統(tǒng)抗血清抗 原免 疫所有抗體混合123412341234脾 臟淋巴結B 細胞傳統(tǒng)抗血清抗 原免 疫所有抗體混合123412341234脾 抗體-a-b-c-d-a -b -c -d抗原決定基BALB/cabbcd傳統(tǒng)抗體 (抗血清) 是所有抗體的混和 脾臟產(chǎn)生各種 B 細胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫 抗原采血后可得傳統(tǒng)抗血清已

7、建立之小鼠骨髓癌細胞株由脾臟收集 B 細胞抗原通常有多個抗原決定基免疫后的脾臟約在兩月內注射五到八次Ag X 抗體-a-b-c-d-a -b - 傳統(tǒng)抗血清的交叉反應專一性反應沒有反應交叉反應+-? 1 2 3 Ag A x y z Ag B 1 2 0 Ag A123123123 傳統(tǒng)抗血清的交叉反應專一性反應沒有反應交叉反應+-? 1 單克隆抗體的特點高度特異性均一性來源穩(wěn)定可大量生產(chǎn) 抗體制藥 1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細胞雜交瘤技術制備出單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）。 單克隆抗體的特點抗體制藥 1975年可生產(chǎn)有用抗體的 淋

8、巴細胞 若與 癌細胞融合，則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細胞株。癌細胞可培養(yǎng)生長漿細胞B cell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長產(chǎn)生專一性抗體一個 B cell 只產(chǎn)生一種抗體可生產(chǎn)有用抗體的 淋巴細胞 若與 癌細胞融合，則形成穩(wěn)定而可 一個 B 細胞只能生產(chǎn)一種抗體，對付某一 抗原決定基。 若有許多抗原決定基，則需許多株 B 細胞分別生產(chǎn)許多抗體。BBBYYYY抗 原BYB親和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基 一個 B 細胞只能生產(chǎn)一種抗體，對付某一 抗原決定基1234mmmm12341234單抗細胞融合取出脾細胞+

9、癌細胞各抗體分開單克隆抗體1234mmmm12341234單抗細胞融合取出脾細胞+各抗 單克隆抗體的應用作為抗體制劑，用于疾病的診斷和治療。檢測與某些疾病有關的抗原，輔助臨床診斷。放射性核素標記單抗進行腫瘤顯像，做免疫定位診斷。CD3單抗作為免疫抑制劑對器官移植免疫排斥有抑制作用。以單克隆抗體作為載體的藥物對腫瘤進行定向治療。抗體制藥 單克隆抗體的應用抗體制藥McAb在免疫導向療法中存在的問題 A、McAb均是鼠源性抗體，應用于人體內可產(chǎn)生人抗鼠抗 體（HAMA），加速了排斥反應，在人體內的半衰期只有56h，維持有效藥物作用靶組織時間； B、完整的抗體分子的相對分子質量過大，難以穿透實體腫瘤組

10、織，達不到有效的治療濃度。需要解決的問題 A、降低McAb的免疫源性； B、降低McAb的相對分子質量。解決問題的方法或途徑基因工程技術 1984年報道了人鼠嵌合抗體，之后制備出了改型抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等多種類型，基本上消除了抗體的鼠源性（免疫源性），相對分子質量只有完整抗體分子的1/801/3。單克隆抗體McAb在免疫導向療法中存在的問題單克隆抗體第二節(jié) 單克隆抗體 單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產(chǎn)生的。由于這種抗體是針對一個抗原決定族的抗體，又是單一的B 淋巴細胞克隆產(chǎn)生的，故稱

11、為單克隆抗體?？贵w制藥第二節(jié) 單克隆抗體 單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細胞與具有抗體制藥抗體制藥抗體制藥抗體制藥-d細胞融合-a-b-c-dAgXAgXHATPEG Cell fusionHybridoma cells 融合瘤細胞（Subcloning） (確定只有一種細胞)ddabcdabcd+-X-d-c-b-a+-dNS-1骨髓癌細胞B cell脾細胞分株培養(yǎng)篩選篩選單抗傳統(tǒng)抗體 (抗血清)試驗專一性對抗原的反應無法分辨完全不同d舊有抗原d新的抗原-d細胞融合-a-b-c-dAgAgHATPEG C 一、抗原與動物免疫 制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當抗原，再用抗原進行動物免

12、疫。 為使雜交瘤細胞穩(wěn)定，免疫動物和骨髓瘤細胞供體同一品系動物進行免疫。 單克隆抗體 一、抗原與動物免疫單克隆抗體 抗原與動物免疫免疫方法：體內免疫和體外免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原骨髓瘤細胞系：來自BALB/c小鼠和 Lou大鼠免疫動物：BALB/c小鼠和Lou大鼠單克隆抗體白化小鼠原種，命名為BALB/c品系。1985年我國從美國引進到中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，為BALB/c第180代。毛色：白化。主要特性：乳腺腫瘤自然發(fā)生率低。易患慢性肺炎。對放射線甚為敏感。與其他近交系相比，肝、脾與體重的比值較大。有自發(fā)高血壓癥，老年鼠心臟有病變，雌雄鼠均有動脈硬化。對鼠傷寒沙門氏菌補體敏感，

13、對麻疹病毒中度敏感。對利什曼原蟲屬、立克次氏體和百日咳組織胺易感因子敏感。主要用途：廣泛地應用于腫瘤學、生理學、免疫學、核醫(yī)學研究，以及單克隆抗體的制備等。BALB/c小鼠 抗原與動物免疫單克隆抗體白化小鼠原種， 體內免疫法 適用于免疫原性強、抗原量較多時應用，一般用812周齡雌性鼠。 顆粒性抗原（如細菌細胞抗原）的免疫原性強，可不加佐劑，直接注入腹腔107個細胞進行初次免疫，間隔13周，再追加免疫12次。 可溶性抗原按每只小鼠10100g抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內，進行初次免疫，間隔24周，再用不加佐劑原抗原追加免疫12次。一般再采脾細胞前3日由靜脈注射最后一次抗原。刺激B細胞分

14、裂。單克隆抗體 體內免疫法單克隆抗體 脾內免疫法即在麻醉下直接將 0.10.2ml抗原注入脾臟進行免疫。細胞抗原需105個，可溶性抗原需10g。體內免疫 脾內免疫法即在麻醉下直接將體內免疫 體外免疫法 用于不能采用體內免疫的情況下，如制備人源性McAb；免疫源性極弱，易引起免疫抑制。 優(yōu)點：需抗源量少，免疫期短，干擾因素少。 操作：用48周齡BALB/c小鼠的脾臟制成單細 胞懸液，再加入適當抗原使其濃度達0.5 5g/ml, 在5% CO2、37 下培養(yǎng)4 5天, 再分離脾細胞,進行細胞融合。體外免疫 體外免疫法體外免疫二、細胞融合與雜交瘤細胞選擇性培養(yǎng)細胞融合的方法 脾細胞（1108） 骨髓

15、瘤細胞（2107） 混合 PEG(2min) 融合 培養(yǎng)液稀釋融合液抗體制藥聚乙二醇（PEG）：融合劑，相對分子量4000，濃度為50%。二甲基亞砜（DMSO）：促融劑，增加融合率。二、細胞融合與雜交瘤細胞選擇性培養(yǎng)抗體制藥聚乙二醇（PEG）融合率高自身不分泌抗體產(chǎn)生的雜交瘤細胞分泌抗體能力強長期穩(wěn)定細胞融合骨髓瘤細胞的特點融合率高細胞融合骨髓瘤細胞的特點 雜交瘤細胞的篩選 細胞融合后可產(chǎn)生多種融合細胞：脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合細胞。 利用HAT選擇性培養(yǎng)基進行淘汰： 次氨甲喋呤（ A ）阻斷DNA合成，淘汰瘤-瘤細胞和瘤細胞、脾-脾細胞、脾細胞；而脾細胞可利用次黃嘌呤（ H ）和胸腺嘧啶（

16、 T ）合成DNA，使脾-瘤融合細胞得以生長。細胞融合 雜交瘤細胞的篩選細胞融合細胞融合細胞融合 三、篩選陽性克隆與克隆化 常用檢測方法免疫酶技術免疫熒光技術放射免疫技術單克隆抗體 三、篩選陽性克隆與克隆化單克隆抗體 克隆化是指單個細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個培養(yǎng)過程。 常用的克隆化方法有限稀釋法：把雜交瘤細胞懸液稀釋后，加入到96孔 板，使每孔中在理論上只含有一個細胞。 第一次克隆化時也要應用HT培養(yǎng)液，以 后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培 養(yǎng)液。軟瓊脂法：在培養(yǎng)液中加入0.5%的瓊脂糖凝膠，細胞 分裂后形成小球樣團塊，由于培養(yǎng)基是半 固體狀態(tài)，可用吸管吸出，移入96孔板

17、培 養(yǎng)。單克隆抗體 克隆化是指單個細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個ELISA用于破傷風抗體的篩選單克隆抗體ELISA用于破傷風抗體的篩選單克隆抗體 四、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定 雜交瘤細胞鑒定染色體分析正常鼠的脾細胞染色體數(shù)：40，全部為端著絲粒。小鼠骨髓瘤細胞染色體：SP2/0細胞為6268，NS-1為 5464， 大多數(shù)為非整倍性，有中部和亞中 部著絲點。雜交瘤細胞的染色體數(shù)目：接近兩親本細胞染色體數(shù)目的總和， 在結構上多數(shù)為端著絲粒染色體外， 還應出現(xiàn)少數(shù)標志染色體。 染色體數(shù)目多且較集中的雜交瘤細胞分泌高效價 的抗體；反之，則反。單克隆抗體 四、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定 單克隆

18、抗體 五、單克隆抗體的大量制備體外培養(yǎng)法：可獲的10g/ml抗體體內誘生法：可獲的520mg/ml抗體 降植烷 BALB/c小鼠 接種雜交瘤細胞 取腹水 離心 上清液單克隆抗體 五、單克隆抗體的大量制備單克隆抗體 六、單克隆抗體的純化 根據(jù)Ig的類和亞類以及用途選擇不同的純化方法。體外診斷試劑IgG類沉淀處理+親和層析IgM類沉淀處理+凝膠過濾體內診斷試劑或治療用藥親和層析+陰離子交 換層析。注意除去毒 素、病毒、核酸等微 量的污染物。單克隆抗體 六、單克隆抗體的純化單克隆抗體動物體內誘生法制備的McAb純化的一般程序 （1）澄清和沉淀處理： 1000g 離心5min，去除沉淀物（紅細胞、細胞

19、碎塊、纖維蛋白凝塊和脂質） 20 000g 高速離心30min ,去除殘留的小顆粒物質 用0.2 m微孔濾膜過濾，去除細菌、支原體 飽和硫酸銨沉淀抗體（50%飽和硫酸銨能回收90%以上的抗體）。單抗純化動物體內誘生法制備的McAb純化的一般程序單抗純化 動物體內誘生法制備的McAb純化的一般程序 （2）分離 A、凝膠過濾：用于IgG和IgM類。常用SephadexG200 為分離介質，收集到3個峰，最高峰為IgM，另外兩個峰為 IgG?？贵w回收率達5080%，能去除微量雜蛋白，純度達95%以上。 B、陰粒子交換層析：用于IgG類。在pH7.4條件下，IgG1和IgG2能結合在DEAE填料上，其

20、中IgG2a可在較低粒子強度下洗脫下來，其純度很高。 IgG2b和IgG3在低離子強度下易發(fā)生沉淀，可增加離子強度以提高產(chǎn)量，但其純度相對較低。 C、親和層析：多用蛋白A親和層析，適用于IgG類。鼠源性單抗在 pH8.0時，IgG2b、IgG3幾乎全部結合在蛋白 A柱上， IgG1稍差，用 pH3.5緩沖液可洗脫 IgG2b，pH4.0緩沖液可洗脫下IgG3，pH4.5緩沖液可洗脫IgG2a， pH6.0可洗脫IgG1。收獲的抗體純度很高，但也有極微量的雜蛋白。單抗純化 動物體內誘生法制備的McAb純化的一般程序單抗純第三節(jié) 鼠源性單克隆抗體的改造 雜交瘤單抗為鼠源性，應用人體產(chǎn)生人抗鼠抗體及

21、毒副作用。對鼠源性的單抗進行基因加工和改造。 目的：降低免疫原性；降低相對分子量，增加組織通透性。單抗改造第三節(jié) 鼠源性單克隆抗體的改造 雜交瘤單抗Ig分子結構單抗改造原理：抗體同抗原結合的功能決定于抗體分子的可變區(qū)（V），同種性免疫原性則決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)（C）。Ig分子結構單抗改造原理：抗體同抗原結抗體制藥-課件1個Fab片段1個Fc片段1個Fab片段1個Fc片段Ig分子的基因結構單抗改造Ig分子的基因結構單抗改造單抗改造單抗改造一、人鼠嵌合抗體（chimeric antibody） 在基因水平上將鼠源單抗的可變區(qū)（V）與人抗體的穩(wěn)定區(qū)（C）融合而得到的抗體。單抗改造一、人鼠嵌合抗體（

22、chimeric antibody） 構建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體穩(wěn)定區(qū)基因及表達所需的其它元件(如啟動子、增強子、選擇標記等)的表達載體上，在哺乳動物細胞(如骨髓瘤細胞、CHO細胞)中表達。單抗改造構建重組表達載體 構建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因 克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用PCR技術分離。 人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇，不同的恒定區(qū)會帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用，可通過點突變來修飾調整其效應。 人-鼠嵌合抗體與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人體內應用，加強ADCC效應

23、。目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關抗原)的嵌合抗體。單抗改造 克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用ADCC效應 即抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用。其機制為靶細胞膜抗原與特異性IgG類抗體結合形成免疫復合物后，IgG抗體的Fc段與效應細胞(如NK細胞、巨噬細胞)上的Fc受體結合，使效應細胞活化，產(chǎn)生對靶細胞的殺傷作用。 單抗改造ADCC效應 即抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用。鼠單抗可變區(qū)的人源化 盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較強的免疫反應。為了進一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術。 CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內

24、，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。單抗改造鼠單抗可變區(qū)的人源化 盡管嵌合抗體的免疫原性已降低二、改形抗體（CDR移植抗體） ( Reshaping antibody ) Ig 分子中參與構成抗原結合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補決定區(qū)（CDR區(qū)），而不是整個可變區(qū)。H和L鏈各有三個CDR，其它部分稱框架區(qū)。 用鼠源單抗的CDR序列替換人Ig 分子中CDR序列，則可使人的Ig 分子具有鼠源單抗的抗原結合特異性。可消除免疫源性。單抗改造CDR區(qū)二、改形抗體（CDR移植抗體） ( Reshaping a單抗改造單抗改造三、小分子抗體 基因工程小分子抗體僅表達鼠源單抗的V區(qū)

25、片段，相對分子量為原抗體的1/801/3。即保留CDR區(qū)，而Ig 分子中的C區(qū)不表達。 小分子抗體類型有 Fab片段抗體： VH+CH1 Fv抗體： VH+VL 單鏈抗體： VH-Linker-VL 單域抗體：VH或VL 最小識別單位（MRU）單抗改造三、小分子抗體 基因工程小分子抗體僅表達鼠源單抗的V小分子抗體的優(yōu)點可以用細菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低;分子小，穿透力強;不含F(xiàn)c，沒有Fc帶來的效應;在體內循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標抗體等。單抗改造小分子抗體的優(yōu)點單抗改造FvScFv單區(qū)抗體最小識別單位Fab小分子抗體FvScFv單區(qū)抗體最

26、小識別單位Fab小分子抗體 由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。 把Fab與細菌的前導肽相連，在前導肽作用下，F(xiàn)ab進入質周腔，裝配折疊后具有結合抗原的活性。（1）Fab （VH+CH1 ）小分子抗體 由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。 Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。（2）Fv（VH+VL）或 ScFv FvScFv連接肽小分子抗體 Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。（2 Fv由VH與VL構成，由于其結合是非共價結合，故Fv不穩(wěn)定。 在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體。 連接肽的長度在10-15個氨基酸左

27、右，不宜太長或太短，它應具有柔軟性，側鏈少，抗原性弱等特點。常用的連接肽是(GGGGS)3。小分子抗體 Fv由VH與VL構成，由于其結合是非共價結合，故Fv不單鏈抗體大多在大腸桿菌中表達直接在細胞質中表達；與其它菌體融合表達融合蛋白；分泌表達具有功能的單鏈抗體。小分子抗體 單鏈抗體大多在大腸桿菌中表達小分子抗體 即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結構域構成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。 （3）單域抗體（VH或VL ）VH小分子抗體 即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結構域構 約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構成，

28、它也保持著抗體的特異性。（4）最小識別單位（MRU）CDR小分子抗體 約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CD四、雙功能抗體 即雙特異性抗體（BsAb）。它是一種非天然性抗體。其結合抗原的兩個臂具有不同的特異性。乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。 單抗改造四、雙功能抗體 即雙特異性抗體（BsAb）。它是一種 雙特異性抗體是指能同時識別2種抗原的抗體。1種為對應腫瘤相關抗原，另1種為對應效應成分。 即能結合靶腫瘤細胞又能結合高細胞毒性的效應細胞，將效應細胞富集在腫瘤周圍，而且可以模擬天然配體的作用,與細胞表面引發(fā)分子結合，激活效應細胞，實現(xiàn)對腫瘤細胞的殺傷和裂解。雙功能抗體 雙特

29、異性抗體是指能同時識別2種抗原的抗體。1種為 雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比，除了能特異性識別腫瘤細胞外，還能將循環(huán)血液中的免疫效應細胞再導向至腫瘤細胞處，從而使效應細胞的抗腫瘤活性增強，發(fā)揮免疫導向作用，這是腫瘤治療的新突破。雙功能抗體 雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比，除了能特異性雙功能抗體多價小分子抗體雙功能抗體多價小分子抗體五、抗體融合蛋白 從廣義講應屬于雙功能抗體范疇。類型：（1）配基配基型融合蛋白，如 CD4-Fc （2）配基Ig型嵌合抗體，如 IL-2-Ig（3）配基FV型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3（4）受體FV型融合蛋白（5）酶抗體型融合蛋白（abeneyme，抗體

30、酶）單抗改造五、抗體融合蛋白 從廣義講應屬于雙功能抗體范疇。類型：單第四節(jié) 基因工程抗體和抗體工程 抗體研究的三個階段：以1890年Behring發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素為代表，其特點是用抗原免疫動物來獲得多克隆抗體；以1975年Khler創(chuàng)建雜交瘤技術制備單克隆抗體為代表；以1994年Winter以基因工程方法制備抗體為代表。通過細菌發(fā)酵或轉基因動物或轉基因植物大規(guī)模生產(chǎn)抗體，在此基礎上發(fā)展成抗體工程。他創(chuàng)建了噬菌體抗體庫技術，克服了人體不能隨意免疫的缺點，用人外周血制備抗體文庫，從而獲得人源性基因工程抗體。抗體制藥第四節(jié) 基因工程抗體和抗體工程 抗體研究的三個階段抗體庫技術 抗體庫技術是用基因工程方

31、法把人或其他動物的全部抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因克隆出來，在原核載體上表達，然后篩選出所需的特異基因和抗體。抗體工程抗體庫技術 抗體庫技術是用基因工程方法把人或其他動一、噬菌體抗體庫技術的基本方法1.獲取目的基因 提取RNA，經(jīng)RT-PCR獲取抗體某一特定基因區(qū)段。2.抗體庫技術的載體 普遍使用噬菌粒（phagemid）載體。3.淘篩（panning） 用固相化抗原對表達產(chǎn)物的載體進行淘篩，淘汰非目的克隆，使目的克隆大量擴增。4.表達與鑒定 目的克隆經(jīng)過鑒定后，再導入感受態(tài)菌株，進行可溶性表達，其產(chǎn)物用Western blot分析確定后，就完成了全過程。抗體工程一、噬菌體抗體庫技術的基本方法1.

32、獲取目的基因抗體工程RT-PCR 將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術?？贵w工程反轉錄酶RNA cDNA 擴增目的片段 PCRRT-PCR 將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的抗體制藥-課件噬菌體抗體庫的“吸附一洗脫一擴增”富集性選擇過程噬菌體抗體庫的“吸附一洗脫一擴增”富集性選擇過程二、噬菌體抗體庫技術的特點1.模擬天然全套抗體庫 抗體文庫可以達到或超過1011庫容，能包含B細胞全部克隆。建庫的外源基因來自人體外周血、骨髓或脾臟的淋巴細胞提取的mRNA反轉錄形成的cDNA擴增，是人體多克隆細胞的總mRNA。使用的通用引物采自多個人體，具有人的種屬普遍性。V

33、H和VL基因的隨機重組增加了抗體的多樣性。2.避開了人工免疫和雜交瘤技術 由于抗體庫的大容量和極高的篩選效率，使得可以調出任意抗體基因，用基因工程方法制備抗體，因而能避免使用人工免疫動物和細胞融合技術。3.可獲得高親和力的人源化抗體 在噬菌體抗體庫技術中，VH和VL基因的隨機重組模擬了體內抗體親和力成熟的過程，所用的抗體基因又來自人體，因此，所產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的人源化抗體?？贵w工程二、噬菌體抗體庫技術的特點1.模擬天然全套抗體庫抗體工程三、基因工程抗體的表達1.原核細胞表達2.真核細胞表達 酵母、昆蟲細胞、中國倉鼠卵細胞、真菌等。3.轉基因植物表達 煙草葉和擬南芥植物。其產(chǎn)量可達葉片

34、總蛋白量的1.3%。4.轉基因動物表達 單基因水平上做轉基因鼠。抗體工程三、基因工程抗體的表達1.原核細胞表達抗體工程第五節(jié) 抗體診斷試劑 抗原抗體特異性結合，在體內和體外均可呈顯某種反應。在體內，可表現(xiàn)為溶菌、殺菌、促進吞噬或中和毒素等作用，故抗體類藥物可用于治療。在體外，由于抗原性狀和反應條件不同，可發(fā)生凝集或沉淀等可見反應，故可用已知抗體來鑒定抗原；做病原學診斷和血型測定，稱為血清學鑒定?？贵w診斷藥物基本分為三類：血清學鑒定用的和免疫標記技術用的抗體制劑，以及體內導向診斷藥物?？贵w制藥第五節(jié) 抗體診斷試劑 抗原抗體特異性一、血清學鑒定用的抗體類試劑1.鑒定病原菌用的抗體試劑（1）常用診斷

35、血清的品種和用途 見書 162頁表46?？贵w診斷試劑一、血清學鑒定用的抗體類試劑1.鑒定病原菌用的抗體試劑抗體診1.鑒定病原菌用的抗體試劑（2）診斷血清的制備步驟a、制備細菌抗原 細菌接種培養(yǎng)收集菌苔制成菌液b、免疫動物和制備抗體血清 動物：家兔、馬、羊、豚鼠。 免疫途徑：靜脈、腹腔、皮下。 接種次數(shù)37次，每次間隔34d，末次注射后68d取血樣測效價，達到要求，即可采血，離心分離血清。c、診斷血清的診斷方法 直接凝集反應。抗體診斷試劑豚鼠1.鑒定病原菌用的抗體試劑抗體診斷試劑豚鼠2.乙型肝炎病毒表面抗原的反向被動血凝診斷試劑（1）試劑制備原理：紅細胞經(jīng)甲醛處理后，在酸性條件下能吸附蛋白質，當

36、純化的抗HBs血清吸附其上時便具有抗體活性，若待測樣品中存在有HBsAg時，則發(fā)生特異性結合而使血細胞發(fā)生凝集。（2）制備步驟：先用HBsAg免疫豚鼠獲得抗HBs血清硫酸銨鹽析/柱層析取其IgG在pH4.0醋酸緩沖液中致敏醛化血細胞洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀釋液稀釋至一定濃度，分裝即成。 （3）診斷方法：在V型血凝板上進行，陰性樣品不凝集，許血細胞沉積于V型孔底部，呈尖點狀；陽性樣品血細胞凝集成塊狀。單抗改造2.乙型肝炎病毒表面抗原的反向被動血凝診斷試劑（1）試劑制3.妊娠診斷試劑 婦女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量增高，在3個月內可達到高峰。此時檢測尿液中的HCG，就可確定是否懷

37、孕。單抗改造 HCG（人絨毛膜促性腺激素）是由胎盤的滋養(yǎng)層細胞分泌的一種糖蛋白，由a-和b-兩個亞單位構成。 正常參考值妊娠周數(shù) HCG（IU/L） 1-2周 50-5002-3周 100-50003-4周 500-100004-5周 1000-500005-6周 10000-1000006-8周 15000-2000002-3月 10000-1000003.妊娠診斷試劑 婦女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量4.抗ABO血型系統(tǒng)血清單抗改造原理：血清學方法檢測ABO血型是根據(jù)抗原、抗體相互作用的原理，檢出能產(chǎn)生抗體的血型抗原。方法：向新鮮血液中加入抗A，抗B，抗O標準血清，離心、振蕩、靜置。細

38、胞沉積在底部（陽性），不凝集孔細胞呈懸浮狀態(tài)（陰性）。4.抗ABO血型系統(tǒng)血清單抗改造原理：血清學方法檢測ABO血二、免疫標記技術用的抗體類試劑 給抗體標記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應放大，使常規(guī)不能觀察的反應得以顯現(xiàn)，可對微量抗原進行定性定量測定，靈敏度提高。結合顯微鏡技術，還可對抗原物質作出組織內或細胞內的定位測定。除臨床診斷外，還能為探討發(fā)病機制提供手段?？贵w診斷試劑二、免疫標記技術用的抗體類試劑 給抗體標記放射性核1.熒光抗體診斷試劑 熒光抗體是用熒光色素，如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有

39、抗原物質的組織切片或細胞，熒光抗體就與抗原結合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達到診斷和定位的目的?？贵w診斷試劑二、免疫標記技術用的抗體類試劑1.熒光抗體診斷試劑抗體診斷試劑二、免疫標記技術用的抗體類試2.免疫酶抗體診斷試劑（酶標診斷試劑） a、HBsAg（乙型肝炎表面抗原）酶標診斷試劑 b、HBeAg（乙型肝炎e抗原）酶標診斷試劑 c、HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶標診斷試劑 d、測定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標診斷試劑 e、AFP（甲胎蛋白）酶標診斷試劑 f、CEA（癌胚抗原）酶標診斷試劑抗體診斷試劑二、免疫標記技術用的抗體類試劑2.免疫酶抗體診斷試劑（酶標診斷試劑）抗體診斷試劑二、免疫標酶聯(lián)免疫吸附測定原理 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱ELISA)是在免疫酶技術(immunoenzymatic techniques) 上發(fā)展起來的一種新型免疫測定技術，ELISA過程包