天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化課件

1、天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化 天然藥物的生物轉(zhuǎn)化一. 生物轉(zhuǎn)化的概念、意義與研究進(jìn)展二. 利用植物組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化三. 利用微生物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化四. 利用生物酶制劑進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化 五. 展望一. 生物轉(zhuǎn)化的概念、意義與研究進(jìn)展生物轉(zhuǎn)化是指利用生物體系（包括微生物、植物和動(dòng)力物）以及生物體系的酶制劑作為催化劑，對(duì)外源性底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾時(shí)所發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。生物轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是生物體系的酶對(duì)外源性底物的催化反應(yīng)。生物催化體系是高效和具有選擇性一個(gè)的溫和催化體系。生物體系中的酶具有高度的化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體專一性。生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以完成許多化學(xué)方法不能或不易完成的反應(yīng)，能夠制備許多包

2、括光學(xué)純的醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及中間體在內(nèi)的復(fù)雜化合物，因此越來(lái)越受到生藥學(xué)和天然藥物化學(xué)工作者的重視。近年來(lái)，我國(guó)的生物轉(zhuǎn)化研究取得了一定的進(jìn)展，但與國(guó)際上相比，差距很大，集中體現(xiàn)在研究的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型和原始創(chuàng)新項(xiàng)目少，研究的酶類型單一。二. 利用植物組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化植物組織細(xì)胞培養(yǎng)液是一類新的生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，能對(duì)映選擇地轉(zhuǎn)化外來(lái)底物 特點(diǎn)：1、植物酶與動(dòng)物酶相比，具有原料易得，易繁殖且不需將酶從細(xì)胞中分離的特點(diǎn)。2、植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化法與微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化法相比，植物細(xì)胞培養(yǎng)液得到的光學(xué)活性產(chǎn)物的光學(xué)產(chǎn)率高于微生物法3、與化學(xué)合成法相比，所需反應(yīng)條件溫和，易于操作，且不需要使用手性誘導(dǎo)物 1.用

3、植物懸浮細(xì)胞作為催化系統(tǒng)進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)2.用固定化植物細(xì)胞作為催化系統(tǒng)進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)3.用毛狀根培養(yǎng)物作為催化系統(tǒng)進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)利用植物組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化主要包括以下三個(gè)方面：方法與舉例桔梗懸浮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)天麻素的生物轉(zhuǎn)化 1、桔梗無(wú)菌苗的獲得 剪取桔梗嫩莖洗凈后用70%酒精浸泡30秒后放入0.1%HgCl2中滅菌15min，用無(wú)菌水沖洗3-5次，取出，剪成約1cm帶節(jié)小段，接種于MS+2.0mg/L 6-BA培養(yǎng)基中進(jìn)行無(wú)菌苗誘導(dǎo)，約1周后，腋芽開(kāi)始啟動(dòng)，3-4周后長(zhǎng)成約5cm小苗。2、桔梗愈傷組織的誘導(dǎo)和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立 切取桔梗無(wú)菌苗的葉片和莖段,于MS+5.

4、0mg/L NAA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織的形成。將繼代3次以上、生長(zhǎng)較好的愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，開(kāi)始3代每10天轉(zhuǎn)接一次，第4-5代后細(xì)胞便能在液體培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)。培養(yǎng)溫度均為25，黑暗培養(yǎng)，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘。3、桔梗懸浮細(xì)胞對(duì)天麻素的生物轉(zhuǎn)化與產(chǎn)物檢測(cè) 底物天麻素用無(wú)水乙醇溶解。待桔梗細(xì)胞生長(zhǎng)到15天時(shí)，用微量移液器吸取一定量的底物加入培養(yǎng)基中，使底物的加入濃度為60mg/L。8天后抽濾回收培養(yǎng)液，并用蒸餾水將培養(yǎng)物清洗3次，合并濾液，用等量乙酸乙脂萃取5次，減壓濃縮溶劑，丙酮-石油醚中結(jié)晶后，進(jìn)行波譜分析。 桔梗懸浮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)天麻素的生物轉(zhuǎn)化 長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞對(duì)

5、天麻素的生物轉(zhuǎn)化 方法與舉例 固定的滿天星細(xì)胞對(duì)苯乙酮的生物轉(zhuǎn)化 1、無(wú)菌滿天星單細(xì)胞的獲得 與前面桔梗愈傷組織的培養(yǎng)方法相同，獲得疏松的愈傷組織后，在500轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)離心30分鐘，通過(guò)400目的細(xì)胞篩后，得到單細(xì)胞溶液。2、 固定細(xì)胞的制備 稱取5克二甲基硅橡膠，0.5克甲基羥基硅油，0.25克正硅酸乙酯和0.07克辛酸亞錫混合均勻。加入懸浮于0.6ml 0.8%NaCl溶液的0.2克滿天星的單細(xì)胞，攪拌均勻。然后緩慢倒入100ml萬(wàn)分之一濃度的鼠李糖脂溶液中。室溫下反應(yīng)2小時(shí)后即可得到顆粒狀的固定化細(xì)胞 3、固定的滿天星細(xì)胞對(duì)苯乙酮的生物轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物的鑒定 取0.2克包的固定化細(xì)

6、胞，加入到40ml 0.05ml/L pH 7.0的磷酸緩沖液中，然后加入0.5ml溶有10mg苯乙酮的乙醇溶液，于25振蕩反應(yīng)。反應(yīng)一定時(shí)間后取出5ml反應(yīng)液，用乙醚提取3次，合并乙醚提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干乙醚。蒸干物可通過(guò)薄層層析定性分析和高壓液相定量分析還原情況。固定的滿天星細(xì)胞對(duì)苯乙酮的生物轉(zhuǎn)化 固定的滿天星細(xì)胞對(duì)苯乙酮的生物轉(zhuǎn)化 3.用毛狀根培養(yǎng)物作為催化劑進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng) 毛狀根就是指利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染離體植物傷口以后，誘導(dǎo)植物形成快速的非向地性的高度分支的無(wú)規(guī)則根團(tuán)。同植物細(xì)胞一樣，毛狀根培養(yǎng)物也可用于生物轉(zhuǎn)化。 與未分化的細(xì)胞培養(yǎng)物相比，毛狀根的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)是很明顯的，它具有增殖速度

7、快（有些植物的毛狀根在一個(gè)周期內(nèi)可增殖1000倍以上），合成和轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)，遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn) 人參毛狀根生物轉(zhuǎn)化氫醌合成熊果苷的反應(yīng)三.用微生物細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)微生物轉(zhuǎn)化就利用微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶催化底物發(fā)生的反應(yīng) 。微生物細(xì)胞的增殖比植物細(xì)胞更快，基因轉(zhuǎn)化表達(dá)，基因重組，原生質(zhì)體融合比動(dòng)植物細(xì)胞更容易成功，所以整個(gè)過(guò)程可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，連續(xù)化，轉(zhuǎn)化效率更高 根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的方式，將微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)分為以下幾類：1、分批培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法（不能連續(xù)使用）2、靜止細(xì)胞轉(zhuǎn)化法（連續(xù)使用，不完成培養(yǎng)基）3、應(yīng)用孢子進(jìn)行轉(zhuǎn)化（雜質(zhì)少，不完成培養(yǎng)基）4、應(yīng)用滲透細(xì)胞進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化（表面活性劑） 四

8、、利用生物體系中的酶制劑進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化的催化劑主要有兩種，全細(xì)胞和游離酶。兩者的實(shí)質(zhì)都是酶，但前者的酶保留在細(xì)胞中，后者則已從細(xì)胞中分離純化。對(duì)于需要利用一種以上的酶和輔酶的復(fù)雜反應(yīng)或不能游離使用的 ，通常采用全細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化，但如果有某一種關(guān)鍵酶就能達(dá)到反應(yīng)目的，則游離的酶更為簡(jiǎn)便。1、游離酶催化的轉(zhuǎn)化反應(yīng)在手性化合物上的研究 合成手性藥物的生物轉(zhuǎn)化可分為兩類：一類是外消旋體拆分為兩個(gè)光活 性的對(duì)映體，另一類是從外消旋體或前體出發(fā)，通過(guò)催化反應(yīng)得到不對(duì) 稱的光活性產(chǎn)物。蛋白質(zhì)酶是由L-氨基酸組成，其活性中心構(gòu)成了一個(gè) 不對(duì)稱環(huán)境，酶只對(duì)外消旋體的單一對(duì)映體起作用，實(shí)現(xiàn)選擇。生物法 生

9、產(chǎn)利用了酶的對(duì)映體催化專一性，只用兩步就可以替代傳統(tǒng)的化學(xué)法 生產(chǎn)，從而減少了工藝流程，提高了產(chǎn)量和純度。2、極端酶催化的轉(zhuǎn)化反應(yīng)在手性化合物上的研究 極端酶是指在極端條件下穩(wěn)定生存，并且具有獨(dú)特的新成代謝途徑的菌種中所含的酶。酶作為生物催化劑，已經(jīng)應(yīng)用于化工，醫(yī)藥轉(zhuǎn)化業(yè)等領(lǐng)域，但是工業(yè) 生產(chǎn)所需要的苛刻條件和酶穩(wěn)定性之間的矛盾長(zhǎng)久以來(lái)一直制約著酶技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用 。因此極端酶作生物催化劑已引起人們關(guān)注。目前已得到在極端溫度 (-215度，60110度)，極端離子強(qiáng)度(25mol/LNaCl),或極端PH(1)環(huán)境中生長(zhǎng)的微生物極端酶 。但是，極端環(huán)境微生物培養(yǎng)條件的嚴(yán)格性或有限的產(chǎn)酶量，限制了極端酶的應(yīng)用。五、展望 近年來(lái)隨著發(fā)酵工程，化學(xué)工程，生化工程以及酶工程等技術(shù)的發(fā)展與綜合應(yīng)用，一些新的方法新的途徑受到人們的關(guān)注，主要包括：1、把生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中涉及到的多個(gè)酶所對(duì)應(yīng)的基因轉(zhuǎn)移到一種快速繁殖的工程菌細(xì)胞中，實(shí)