Minitab軟件在多殺菌素發(fā)酵條件優(yōu)化中的應(yīng)用

1、Minitab軟件在多殺菌素發(fā)酵條件優(yōu)化中的應(yīng)用【關(guān)鍵詞】多殺菌素；initab軟件；響應(yīng)面方法(RS)；優(yōu)化KEYRDSSpinsad;initabsftare;Respnsesurfaeethds;Ferentatinptiizatin1材料和方法1.1菌種1.2培養(yǎng)基初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖60，麥芽糖10，棉籽粉20，玉米漿15，硫酸鋅0.2，硫酸銨1.5，a35；pH7.07.5(用NaH調(diào)節(jié))。1.3培養(yǎng)方法(1)菌種活化和種子培養(yǎng)將4保藏的斜面菌種轉(zhuǎn)接到新穎的斜面上，30生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)710d；取一環(huán)斜面活化菌種接入30l種子培養(yǎng)基，在30溫度下220r/in搖床中振蕩培

2、養(yǎng)60h。(2)發(fā)酵培養(yǎng)取種子培養(yǎng)液以10%的接種量接入30l發(fā)酵培養(yǎng)基，在30溫度下220r/in搖床中振蕩培養(yǎng)7d，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值。搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的裝液量均為30l的培養(yǎng)基于250l的錐形瓶中。1.4產(chǎn)物檢測(cè)方法取5.0l同批發(fā)酵液，參加5.0l甲醇，充分振蕩，超聲波處理15in，室溫浸提12h；5000r/in離心10in；取上清液經(jīng)0.45微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)展高效液相色譜分析(HPL)。色譜柱為L(zhǎng)abAlliane18反相柱(2504.6，5)；檢測(cè)器為UV檢測(cè)器(del500，美國(guó))，波長(zhǎng)246n；流動(dòng)相為甲醇乙腈乙酸銨水溶液(1%，/v)=40555(v/v)；流速

3、：1.0l/in；柱溫：30；進(jìn)樣量：20l。1.5響應(yīng)面方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)在initab軟件中，按照initabStatDEFatrialAnalyzeFatrialDesign的順序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)展分析。(2)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析方法在initab軟件中，按照initabStatDERespnseSurfaereateRespnseSurfaeDesignentralpsite的順序，對(duì)PB實(shí)驗(yàn)挑選得到的顯著性因素進(jìn)一步優(yōu)化，進(jìn)展4因素5程度的31組中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)編碼為0，0，0，0，實(shí)驗(yàn)的實(shí)際濃度選取PB實(shí)驗(yàn)中上下程度濃度的中點(diǎn)值，即葡萄糖70g/L，棉籽粉25g/L，

4、玉米漿15g/L，初始pH7.2，其余的非顯著因素濃度取初始培養(yǎng)基的配方值。2結(jié)果與討論按照1.5(1)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法考察葡萄糖(X1)，麥芽糖(X2)，棉籽粉(X3)，玉米漿(X4)，硫酸鋅(X5)，硫酸銨(X6)，接種量(X7)和初始pH(X8)8個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值Y(多殺菌素產(chǎn)量)的影響，各因素的程度和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)Tab.1和Tab.2。按1.5(1)的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)展分析，得到各因素對(duì)響應(yīng)值的影響效應(yīng)如Tab.3所示。從Tab.3可以看出，在多殺菌素的發(fā)酵消費(fèi)中，X1、X3、X4和X8是主要的影響因素，在95%的概率程度上影響顯著。X2和X5的影響為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)當(dāng)取其低程度，X6和X7的影響

5、為正效應(yīng)，取其高程度，因此根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步確定非顯著影響因素的程度：即麥芽糖10g/L，硫酸鋅0.2g/L，硫酸銨1.5g/L，接種量10%。2.2中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果按照1.5(2)確定的各因素編碼程度和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)，各因素編碼程度及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)Tab.4和Tab.5。2.3響應(yīng)面分析利用initab軟件，按照initabStatDERespnseSurfaeAnalyzeRespnseSurfaeDesign的順序，對(duì)中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)展響應(yīng)面分析，分析結(jié)果見(jiàn)Tab.6所示。從表Tab.6中可以看出，X1、X2、X3和X4即葡萄糖、棉籽粉、玉米漿和初始pH四

6、個(gè)因素對(duì)多殺菌素產(chǎn)量都有顯著的影響，而且線性和曲面效應(yīng)都很顯著。2.4響應(yīng)面方程的建立根據(jù)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果得到的各因素效應(yīng)系數(shù)，建立多殺菌素產(chǎn)量對(duì)四個(gè)顯著影響因素的多元二次方程，如式(1)所示。對(duì)方程進(jìn)展方差分析結(jié)果見(jiàn)Tab.7所示。Y=-21046+106.803333+83.780771+159.691778+4294.930804-0.767869+0.380000-2.134358+0.070000+0.115625-1.170108-1.825000-0.104167-17.953125-274.605655(1)該回歸方程的相關(guān)系數(shù)為R2=0.970，只有3%的數(shù)值失擬，說(shuō)明該模型方程

7、可以較好的用于多殺菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基組分及其產(chǎn)量的預(yù)測(cè)。從回歸方程的方差分析可以看出，模型的回歸效果高度顯著，說(shuō)明該模型可以很好的擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，另外，回歸方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響顯著，說(shuō)明RS法所選的因素對(duì)多殺菌素產(chǎn)量影響的效應(yīng)顯著。在initab軟件中，按照initabStatDERespnseSurfaenturSurfae(irefrae)Plts的順序，設(shè)置不同的因素，就可得到軟件自動(dòng)生成的響應(yīng)值與任意兩個(gè)因素關(guān)系的響應(yīng)面圖和對(duì)應(yīng)的等高線圖，F(xiàn)ig.1給出了多殺菌素產(chǎn)量與葡萄糖濃度以及玉米漿濃度的響應(yīng)面圖和等高線圖。由initab軟件中2因素響應(yīng)面圖可以看出，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，多殺菌素產(chǎn)量

8、存在最大值。對(duì)所得的回歸方程分別求四個(gè)變量的一階偏導(dǎo)數(shù),并令其為0，得到四元一次方程組,求解即可得到多殺菌素產(chǎn)量獲得最大值時(shí)的最正確培養(yǎng)條件：葡萄糖濃度68.5g/L，棉籽粉濃度26.0g/L，玉米漿濃度17.8g/L，初始pH7.0，此時(shí)多殺菌素產(chǎn)量為168g/L。2.5回歸模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析得到優(yōu)化培養(yǎng)基配方(g/L)：葡萄糖68.5，麥芽糖10，棉籽粉26.0，玉米漿17.8，牛肉膏2.0，硫酸鋅0.2，硫酸銨1.5，a35。培養(yǎng)條件：接種量10%，初始pH7.0，搖床轉(zhuǎn)速220r/in，培養(yǎng)7d。在此培養(yǎng)條件下進(jìn)展多殺菌素的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，得到多殺菌素的產(chǎn)量為175g/L，與

9、優(yōu)化前(120g/L)相比產(chǎn)量進(jìn)步了45.8%，與模型預(yù)測(cè)值168g/L之間的誤差5%。3結(jié)論(1)采用響應(yīng)面方法(RS)對(duì)初始發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)展優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L)葡萄糖68.5，麥芽糖10，棉籽粉26.0，玉米漿17.8，牛肉膏2.0，硫酸鋅0.2，硫酸銨1.5，a35。培養(yǎng)條件為接種量10%，初始pH7.0，搖床轉(zhuǎn)速220r/in，培養(yǎng)7d。在此培養(yǎng)條件下進(jìn)展多殺菌素的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，得到多殺菌素的產(chǎn)量為175g/L，與優(yōu)化前(120g/L)相比產(chǎn)量進(jìn)步了45.8%。(2)將initab軟件用于生物農(nóng)藥發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化中，集實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果數(shù)值分析、圖表直觀分析、模型方程回歸于一體，表達(dá)

10、了一種工具多種功能利用的時(shí)效性，不但減少了工作量，使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析簡(jiǎn)單Nte:1:nentratinfSpinsad;2:nentratinfGluse;3:nentratinfrnSteepLiquidFig.13Dandisrespnsenturpltfrespnsesurfaefuntin化，而且獲得了較傳統(tǒng)優(yōu)化方法更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為多殺菌素等抗生素發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化軟件的應(yīng)用提供了新的思路?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1arsnG,TruhleJT，.Effetfinsetiidesneleryinsets1995J.ArthrpdanagTests,1997,22:117.2RileyDG.Evalu

11、atinfinsetiidetreatentsnabbageJ.ArthrpdanagTests,1998,23:82.3Kevinanner,BlairVHelsnandBrendaJHarris.Labratryandfieldevaluatinfspinsadagainstthegypsyth,LyantriadisparJ.PestanagSi,2000,56(10):855860.4ShnverJR,LarsnLL.LabratryativityfspinsadnnntargetbenefiialarthrpdsJ.ArthrpdanagTests,1995,20(5):357.5ruseGD,SparksT,ShnverJ,etal.ReentadvanesintheheistryfspinsynsJ.PestanagSi,2001,57(2):177185.6JnesT,DupreeS,HarrisR.Theeffiayfspinsadagainsttheesternflerthrips,Frankliniellaidentalis,anditsipatnassiatedbilgialntrlagentsngre