反硝化細菌項目說明書

1、篩選好氧反硝化細菌處理工業(yè)廢水設(shè)計說明書設(shè)計者 呂海鵬 鹿宗貴 韓飛怡指導(dǎo)老師 柯濤（南陽師范范學院生生命科學學與技術(shù)術(shù)學院 河南 南陽 44730061）摘要 通過過定向富富集，從從污水處處理池活活性污泥泥中篩選選出具有有高效降降解亞硝硝態(tài)氮能能力的好好氧反硝硝化細菌菌，并在在實驗室室條件下下，對該該菌株在在天然水水體中的的反硝化化活性進進行系統(tǒng)統(tǒng)的研究究，制作作出可用用于生物物脫氮的的微生態(tài)態(tài)菌劑。該菌劑具有成本低、易操作、達標排放可靠性強且無二次污染等優(yōu)點。關(guān)鍵詞 污污水處理理廠 好氧反反硝化細細菌 微生態(tài)態(tài)制劑 生物脫脫氮作品內(nèi)容簡簡介本研究是以以污水處處理池中中活性污污泥為原原料，篩

2、篩選出具具有高效效降解亞亞硝態(tài)氮氮能力的的好氧反反硝化細細菌，生物脫脫氮以其其無污染染、脫氮氮徹底等等優(yōu)點被被認為是是目前最最經(jīng)濟、有有效、可可行性高高的水體體除氮方方法。但但由于種種種原因因,目前前國內(nèi)外外市場尚尚無可有有效治理理水體亞亞硝態(tài)氮氮污染的的微生態(tài)態(tài)制劑產(chǎn)產(chǎn)品。本本研究分分離得到到的反硝硝化菌菌菌株具有有良好的的脫氮效效果。應(yīng)應(yīng)用于廢廢水脫氮氮，能適適應(yīng)各種種不良的的環(huán)境條條件，具具有開發(fā)發(fā)成微生生態(tài)制劑劑應(yīng)用于于受污染染水體脫脫氮的巨巨大潛力力。市場場潛力大大，應(yīng)用用前景廣廣闊，具具有顯著著的社會會、經(jīng)濟濟效益，具有很很高的推推廣應(yīng)用用價值。本研究采用用定向富富集（反反復(fù)篩選選

3、）的方方法，從污水水處理池池活性污污泥中篩篩選出具具有高效效降解亞亞硝態(tài)氮氮能力的的好氧反反硝化細細菌。該該方法操操作簡便便、可行行，反復(fù)復(fù)篩選具具有成本本低、易操作作、達標排排放可靠靠性強且且無二次次污染等等優(yōu)點。具有較較好的科科學性和和先進行行。不僅僅降低了了工業(yè)廢廢水對水水體環(huán)境境的危害害，還可可制得環(huán)環(huán)保、高高效去除除水體富富營養(yǎng)化化的微生生物菌劑劑，由此此帶來的的環(huán)境效效益和社社會經(jīng)濟濟效益是是非常顯顯著的。按本方法篩篩選到的的好氧反反硝化細細菌市場場潛力大大，推廣廣應(yīng)用前前景廣闊闊，具有有顯著的的經(jīng)濟效效益我國國每年用用于環(huán)境境污染投投資約為為8300億元，約約占當年年GDPP的1

4、%。盡盡管如此此，水環(huán)環(huán)境污染染趨勢仍仍然沒有有得到有有效控制制，每年年由于水水質(zhì)污染染引起的的損失共共約為5500億億元。同時，項項目實施施后可安安排社會會閑散人人員就業(yè)業(yè)，減輕輕就業(yè)壓壓力，產(chǎn)產(chǎn)生較好好的社會會效益。利用活性污泥篩選出TIN 去除率較高的好氧反硝化細菌，不僅能減少工業(yè)廢水對環(huán)境的污染，而且能充分利用資源，變廢為寶，具有顯著的環(huán)境效益。聯(lián)系人：呂呂海鵬 155893338664844 m 研究背景及及意義20世紀660年代代以來，世世界上水水體污染染達到極極為嚴重重的程度度，震驚驚世界的的幾起公公害事件件相繼發(fā)發(fā)生，引引起了科科學界和和政界的的重視，保保護環(huán)境境，治理理污染成

5、成了人們們普遍關(guān)關(guān)注的問問題，而而工業(yè)廢廢水的不不合理排排放更是是關(guān)注的的焦點。我國每天排放大量的工業(yè)的廢水，對江河湖海造成嚴重的污染。據(jù)統(tǒng)計，全國27條主要河流，大多數(shù)被嚴重污染，工業(yè)廢水的不合理排放不僅增加水處理的難度和用水成本，還引發(fā)嚴重的生態(tài)問題，導(dǎo)致江河湖海含有過量的氮、磷營養(yǎng)物質(zhì)，使藻類和其他水生生物大量繁殖，造成水質(zhì)惡化，形成水體“富營養(yǎng)”和“水華”現(xiàn)象。同時我國是世界水產(chǎn)生產(chǎn)大國，水產(chǎn)品總量十幾年來一直位居世界第一。據(jù)統(tǒng)計，2004年我國水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量達到3209萬噸，占世界水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的三分之二以上。但目前主要采用的集約化高密度養(yǎng)殖，如施肥給餌和密集輪養(yǎng)等養(yǎng)殖方式，會在養(yǎng)殖水

6、體中積累大量的魚類糞便、食物殘渣和死亡的動植物尸體，導(dǎo)致水體氮素含量嚴重超標，富營養(yǎng)化情況嚴重，魚蝦病害頻頻發(fā)生，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)尤其是高檔精養(yǎng)池塘造成巨大損失。作為水體氮素存在形式之一的亞硝酸鹽的控制一直是水產(chǎn)科學工作者研究的熱點。這是因為它是水產(chǎn)動物致病的根源之一，其危害主要表現(xiàn)在它可以將魚蝦體內(nèi)的亞鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，使其喪失運輸氧的能力，從而造成魚蝦的窒息死亡。我國淡水漁業(yè)用水標準規(guī)定, 養(yǎng)殖水質(zhì)中的亞硝酸鹽氮應(yīng)控制在0.2ppm以下，河蟹、對蝦育苗水質(zhì)的亞硝酸鹽氮應(yīng)控制在0.1ppm以下。 本項目研研究的生生物修復(fù)復(fù)技術(shù)是是一種治治污新模模式，通通過定向向富集，從污水處理池活性

7、污泥中篩選出TIN 去除率較高的好氧反硝化細菌，并在實驗室條件下，對該菌株在天然水體中的反硝化活性進行系統(tǒng)的研究，制作出可用于生物脫氮的微生態(tài)菌劑在廢水處理方面,同步硝化反硝化相對于傳統(tǒng)的生物脫氮工藝具有明顯的優(yōu)勢。通過微生態(tài)制劑的直接投放，以及魚類和水生植物的協(xié)同作用達到凈水的目的。它具有高效、無二次污染，成本低、投資省，使用簡單易操作等特點。本著消除污染，篩選高效去除水體富營養(yǎng)化的微生物菌劑，進而促進經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。利用活性污泥篩選出TIN 去除率較高的好氧反硝化細菌，不僅能減少工業(yè)廢水對環(huán)境的污染，而且能充分利用資源，變廢為寶，具有顯著的環(huán)境效益。2 作品品研究內(nèi)內(nèi)容2.1研制制目的本

8、著充分利利用資源源、消除除污染，制制取可高高效去除除水體富富營養(yǎng)化化的微生生物制劑劑，促進進經(jīng)濟的的可持續(xù)續(xù)發(fā)展為為目的。而而從活性性污泥中中篩選好好氧反硝硝化細菌菌。2.2實驗驗材料和和方法 2.2.1實驗驗主要儀儀器、原原料及試試劑主要儀器:超凈工工作臺（SSWCJJ-A），高壓壓蒸汽滅滅菌鍋，恒恒溫培養(yǎng)養(yǎng)箱(SSPX-1600型)，搖搖床（HHNY-2000D），電子子天平等等。主要原料及及試劑:BTBB培養(yǎng)基基（瓊脂脂20 g、KNOO3 11 g、KH22PO44 1 g、FeCCl26H22O 00.5 g、CaCCl27H22O 00.2 g、MgSSO47H22O 11 g、琥

9、珀酸酸鈉8.5 gg、溴百里里酚藍(BTBB)(11%乙醇醇溶液)1 mmL，用用1 mmol/L 的的NaOOH 調(diào)調(diào)節(jié)pHH 至7.007.33，1211 滅菌200 miin），LLB培養(yǎng)養(yǎng)基（KNOO3 11 g、KH22PO44 1 g、FeCCl26H22O 00.055 g、CaCCl27H22O 00.022 g、MgSSO47H22O 11 g、琥珀酸酸鈉8.5 gg，1211 滅菌200 miin）。格格里斯試試劑A、BB液，二二苯胺試試劑，其其他試劑劑均分析析純。取樣 南陽市污水水處理廠廠曝氣池池中活性性污泥；南陽師院十十二里河河污泥；南陽師院陽陽子湖湖湖水；南陽師院周周

10、圍麥田田土樣。2.2.33實驗方方法.好氧反反硝化細細菌的初初篩采用梯度稀稀釋法將將污泥樣樣品稀釋釋至適當當濃度，取取0.11 mLL 均勻勻涂布于于BTBB 培養(yǎng)養(yǎng)基表面面，置入入恒溫培培養(yǎng)箱，30 下培養(yǎng)23 d 后，用接種環(huán)挑取使周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)藍色暈圈的單菌落，進行分離純化即為初篩菌株。.好氧反反硝化細細菌的復(fù)復(fù)篩將初篩篩選選出的好好氧菌株株接種到到LB液液體培養(yǎng)養(yǎng)基的試試管中, 每支支試管分分裝培養(yǎng)養(yǎng)基的高高度約為為 45cmm，每株株重復(fù) 3 管管，在 30恒溫下下培養(yǎng) 7d 以上，每每天觀察察其生長長情況，檢檢查試管管是否混混濁。并并用格里里斯（GGrieess）試試劑檢查查培養(yǎng)液

11、液中是否否已出現(xiàn)現(xiàn)亞硝酸酸根。如如果呈桃桃紅或紅紅色反應(yīng)應(yīng)，說明明硝酸鹽鹽已經(jīng)在在反硝化化菌作用用下生成成亞硝酸酸鹽，即即為正反反應(yīng)。如如為負反反應(yīng)，則則就要檢檢查培養(yǎng)養(yǎng)液中是是否還有有硝酸根根，即置置白瓷板板凹窩中中加濃硫硫酸和二二苯胺試試液各 2 滴滴，然后后滴入待待測液 122 滴，如如果有藍藍色出現(xiàn)現(xiàn)，說明明有硝酸酸根存在在，即未未進行反反硝化作作用，受受檢查管管無反硝硝化細菌菌存在，如如不出現(xiàn)現(xiàn)藍色，則則說明硝硝酸根已已完全消消失，且且作為硝硝化作用用中間產(chǎn)產(chǎn)物的亞亞硝酸根根也完全全消失，這這證明受受檢查管管的反硝硝化作用用很強烈烈，有反反硝化細細菌存在在，檢查查時應(yīng)與與空白對對照，

12、將將檢出具具有反硝硝化作用用的好氧氧菌作為為復(fù)篩菌菌911，并并將其接接種于 3 號號培養(yǎng)基基的試管管斜面，作作為備用用菌。2.3分析析方法 該方方法是利利用在培培養(yǎng)液中中滴加格格里斯試試劑、二二苯胺試試劑和奈奈氏試劑劑,通過顯顯色反應(yīng)應(yīng)指示亞亞硝態(tài)氮氮、硝態(tài)態(tài)氮和氨氨態(tài)氮的的變化 311 ,從而而篩選出出對硝態(tài)態(tài)氮有較較強利用用效果的的菌株。在在培養(yǎng)液液中加入入12滴格里里斯試劑劑,以檢測測是否有有亞硝酸酸鹽的存存在,如溶液液立即呈呈粉紅色色或棕色色等,則硝酸酸鹽被還還原成亞亞硝酸鹽鹽,說明該該溶液中中具有好好氧反硝硝化作用用的細菌菌。如無無紅色出出現(xiàn),再加入入二苯胺胺試劑,若培養(yǎng)養(yǎng)液呈藍藍

13、色,則表示示該培養(yǎng)養(yǎng)液中硝硝酸鹽未未被轉(zhuǎn)化化,溶液中中無反硝硝化細菌菌;若無色色,則表示示硝酸鹽鹽和剛生生成的亞亞硝酸鹽鹽都已原原成氮氧化物物,說明該該溶液中中具有較較強好氧氧反硝化化功能的的細菌。2.3菌株株的分離離與鑒定定從十二里河河的污泥泥中篩選選到200株生長長比較旺旺盛，反反硝化能能力較強強的好氧氧反硝化化細菌，分分別接入入含有硝硝酸鉀的的LB培培養(yǎng)基中中培養(yǎng)22-3dd通過格格里斯試試劑檢測測菌株的的反硝化化速度，先先有無色色粉粉紅色玫瑰瑰紅色棕色色無無色（滴滴入二苯苯胺仍為為無色）先先完成這這個過程程的細菌反消化能能力較強強，每隔隔12個個小時檢檢測一次次，從中中篩選88株菌做做

14、鑒定。菌株編號格里斯試劑劑檢測結(jié)結(jié)果12h后24h后36h后48h后1粉紅色玫瑰紅色棕色無色2無色粉紅色玫瑰紅色棕色3粉紅色玫瑰紅色棕色無色4無色無色粉紅色玫瑰紅色5無色無色粉紅色玫瑰紅色6粉紅色玫瑰紅色棕色無色7無色粉紅色玫瑰紅色棕色8無色粉紅色玫瑰紅色棕色9粉紅色玫瑰紅色棕色無色10無色粉紅色玫瑰紅色棕色11粉紅色玫瑰紅色棕色無色12無色無色粉紅色玫瑰紅色13粉紅色玫瑰紅色棕色無色14無色粉紅色玫瑰紅色棕色15粉紅色玫瑰紅色棕色無色16無色粉紅色玫瑰紅色棕色17粉紅色玫瑰紅色棕色無色18無色粉紅色玫瑰紅色棕色19無色無色粉紅色玫瑰紅色20無色無色無色粉紅色通過上表分分析得11、3、66、9

15、、111、113、115、117號菌菌株為反反硝化能能力強的的優(yōu)勢菌菌株。將8株菌接接種后第第2天即產(chǎn)產(chǎn)生大量量氣泡,迅速降降解亞硝硝態(tài)氮和和總氮的的菌株。6號菌株通過革蘭氏染色法在顯微鏡下觀察鑒定該菌株為革蘭式陽性菌株，同時進行顯微拍照觀察該菌的外形為球形。2.4菌株株反硝化化特性靜置培養(yǎng)條條件下，菌菌株在接接種后的的3h進入入了對數(shù)數(shù)生長期期，在110h菌菌體濃度度達到最最高，隨隨后進入入生長穩(wěn)穩(wěn)定期，在在23hh左右進進入衰亡亡期。在在對數(shù)生生長期，由由于培養(yǎng)養(yǎng)基中含含有豐富富的營養(yǎng)養(yǎng)物質(zhì)，此此時用于于菌體增增殖的氮氮源主要要是培養(yǎng)養(yǎng)基中的的有機氮氮，而在在生長穩(wěn)穩(wěn)定末期期及衰亡亡期，菌

16、菌體基本本不再增增殖，此此時培養(yǎng)養(yǎng)基中的的亞硝態(tài)態(tài)氮濃度度的變化化應(yīng)該是是由于反反硝化作作用引起起的。反硝化碳源源通常分分為三種種類型:第一類類是易于于生物降降解的有有機物,如實驗驗中采用用的甲醇醇、乙醇醇、蔗糖糖、葡萄萄糖等;第二類類為可慢慢速生物物降解的的有機物物,如實實驗中的的可溶性性淀粉等等;第三類類為細胞胞物質(zhì),細菌會會利用細細胞成分分進行內(nèi)內(nèi)源反硝硝化。碳碳源的種種類對菌菌株的反反硝化活活性有很很大影響響。一般般來說，在反硝化過程中，易于生物降解的有機物是最好的電子供體，不僅反硝化速率快，還能夠提高生物處理裝置的能力和效率，使反硝化過程穩(wěn)定可靠102.5 反反硝化碳碳源試驗驗以LB

17、培養(yǎng)養(yǎng)基（KNOO3 11 g、KH22PO44 1 g、FeCCl26H22O 00.055 g、CaCCl27H22O 00.022 g、MgSSO47H22O 11 g、蒸蒸餾水110000ml、PPH7.077.3為為基礎(chǔ)培培養(yǎng)基，分分別加入入不同碳碳源檸檬檬酸鈉110g、乙乙醇100g、醋醋酸鈉110g、葡葡萄糖110g、可可溶性淀淀粉100g、甲甲醇100g作為為唯一碳碳源配制制培養(yǎng)基基。按11接種種量接入入活化并并用無菌菌水洗滌滌干凈的的菌液，30靜置培養(yǎng)60h后檢測培養(yǎng)基中亞硝態(tài)氮的降解率。2.5.11BTTB平板板篩選法法該方法適用用于對培培養(yǎng)條件件有特殊殊營養(yǎng)要要求的某某種

18、好氧氧反硝化化菌的定定向篩選選。運用用此方法法在好氧氧條件下下，利用用平板的的抑菌圈圈大小，篩篩選到對對不同碳碳源適應(yīng)應(yīng)能力不不同的220株好好氧反硝硝化細菌菌菌株。2.6菌株株在天然然養(yǎng)殖水水體中的的反硝化化特性取回的陽子子湖水樣樣經(jīng)處理理后,分分為兩部部分，一一份加入入硝酸鉀鉀（氮源源）和葡葡萄糖（碳碳源），分分別取550mll分裝于于四個錐錐形瓶中中，一組組只加入入硝酸鉀鉀，取550mll裝入一一個錐形形瓶中，1121,300minn滅菌處處理后，將將不同濃濃度的菌菌種（11ml）接接入錐形形瓶中，228恒恒溫培養(yǎng)養(yǎng)。用格格里斯試試劑定時時檢測顏顏色變化化。加N、C只加N無CC加N、C加

19、N、C加N、C投菌濃度（個/L）檢測時間（hh）不投菌3107731077310883109912h無色無色無色粉紅色玫瑰紅色16h無色無色無色玫瑰紅色棕色20h24h30h36h2.7投菌菌濃度試試驗將不同濃度度的菌種種投入陽陽子湖水水中，用用格里斯斯試劑定定時檢測測降解天天然水中中氮的速速度。加N、C加N、C加N、C加N、C投菌濃度（個/L）檢測時間（hh）不投菌31077310883109912h16h20h24h30h36h天然水體中中存在著著相當數(shù)數(shù)量的土土著微生生物，它它們和實實驗中人人工投加加的菌體體存在著著相互競競爭的關(guān)關(guān)系。從從工程實實際應(yīng)用用出發(fā),為了確保保所投加加的微生生

20、物能在在天然水水體中發(fā)發(fā)揮應(yīng)有有的反硝硝化作用用,有必要要從實際際應(yīng)用的的可操作作性出發(fā)發(fā),確定合合適的投投菌量。隨著投菌量量的增加加，亞硝硝態(tài)氮的的降解率率逐漸升升高；當當投菌濃濃度達到到108個/LL時，菌菌株即可可在水體體中發(fā)揮揮高效的的反硝化化作用。說說明該菌菌株具有有較強的的生存能能力和環(huán)環(huán)境適應(yīng)應(yīng)能力，在在天然水水體中具具有較強強的競爭爭力。產(chǎn)品性能分分析生物脫氮以以其無污污染、脫脫氮徹底底等優(yōu)點點被認為為是目前前最經(jīng)濟濟、有效效、可行行性高的的水體除除氮方法法。但由由于種種種原因,目前國國內(nèi)外市市場尚無無可有效效治理水水體亞硝硝態(tài)氮污污染的微微生態(tài)制制劑產(chǎn)品品。分離離得到的的微生

21、物物菌劑已已在國內(nèi)內(nèi)多個水水塘進行行了中試試試驗,均取得得了良好好的脫氮氮效果。加之芽孢孢桿菌具具有很強強的生命命力和旺旺盛的繁繁殖能力力，能適適應(yīng)各種種不良的的環(huán)境條條件，受受水體酸酸堿度、鹽鹽度等影響較小小，因此此該菌株株具有開開發(fā)成微微生態(tài)制制劑應(yīng)用用于受污污染水體體脫氮的的巨大潛潛力。研制結(jié)論及及應(yīng)用本研究采用用定向富富集（反反復(fù)篩選選）的方方法，從污水水處理池池活性污污泥中篩篩選出TTIN去去除率較較高的好好氧反硝硝化細菌菌。該方方法操作作簡便、可可行，反反復(fù)篩選選具有成成本低、易操作作、達標排排放可靠靠性強且且無二次次污染等等優(yōu)點。具有較較好的科科學性和和先進行行。不僅僅降低了了工

22、業(yè)廢廢水對水水體環(huán)境境的危害害，還可可制得環(huán)環(huán)保、高高效去除除水體富富營養(yǎng)化化的微生生物菌劑劑，由此此帶來的的環(huán)境效效益和社社會經(jīng)濟濟效益是是非常顯顯著的。該制備技術(shù)術(shù)具有如如下特： eq oac(,1)方方法操作作簡便、可可行，反反復(fù)篩選選具有成成本低、易操作作、達標排排放可靠靠性強且且無二次次污染等等優(yōu)點。 eq oac(,2)使使硝化/反硝化化反應(yīng)在在同一個個反應(yīng)器器中進行行,可以大大大減少少占地面面積和建建設(shè)資金金; eq oac(,3)可可以減少少處理過過程中加加入調(diào)節(jié)節(jié)系統(tǒng)ppH值的的化學物物質(zhì),降低成成本;好氧反反硝化細細菌在處處理過程程中更容容易控制制。 eq oac(,4)它

23、它的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)打破了了反硝化化只能在在缺氧或或厭氧條條件下進進行的傳傳統(tǒng)觀點點,為新型型生物脫脫氮提供供了新思思路.應(yīng)用按本方法篩篩選到的的好氧反反硝化細細菌市場場潛力大大，推廣廣應(yīng)用前前景廣闊闊，具有有顯著的的經(jīng)濟效效益我國國每年用用于環(huán)境境污染投投資約為為8300億元，約約占當年年GDPP的1%。盡盡管如此此，水環(huán)環(huán)境污染染趨勢仍仍然沒有有得到有有效控制制，每年年由于水水質(zhì)污染染引起的的損失共共約為5500億億元。同時，項項目實施施后可安安排社會會閑散人人員就業(yè)業(yè)，減輕輕就業(yè)壓壓力，產(chǎn)產(chǎn)生較好好的社會會效益。利用活性污泥篩選出TIN 去除率較高的好氧反硝化細菌，不僅能減少工業(yè)廢水對環(huán)境的污染，而且能充分利用資源，變廢為寶，具有顯著的環(huán)境效益。附錄：BTB培養(yǎng)養(yǎng)基平板板初篩復(fù)篩過程中中抑菌圈圈篩選的好氧氧反硝化化菌斜面面保存的的形態(tài)特特征圖格里斯試劑劑染色后后六號好好氧反硝硝化菌株株油鏡下下顯微觀觀察照片片（1001000）格里斯試劑劑的顯色色反應(yīng)圖圖示參考文獻1 沈沈萍.微生物物學.MMJ.北北京:高高等教育育出版社社，20000，11542 翟翟茜