滾環(huán)擴(kuò)增介導(dǎo)的核酸信號(hào)放大策略在生物傳感器中的應(yīng)用研究進(jìn)展

1、滾環(huán)擴(kuò)增介導(dǎo)的核酸信號(hào)放大策略在生物傳感器中的應(yīng)用研究進(jìn)展摘 要：滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）是一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，因其具有擴(kuò)增效率高、保真度高等特點(diǎn)，在生物傳感器 領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。該文介紹了 RCA技術(shù)的基本原理、RCA環(huán)狀模（環(huán)化方式和RCA的擴(kuò)增類型，并 對(duì)基于RCA技術(shù)的熒光、比色以及電化學(xué)生物傳感器進(jìn)行了介紹，旨在為RCA技術(shù)在生物傳感器領(lǐng)域的進(jìn) 一步發(fā)展和應(yīng)用提供參考。關(guān)鍵詞：等溫核酸擴(kuò)增；滾環(huán)擴(kuò)增；生物傳感器Advances on Application of Rolling Circle Amplificationmediated Nucleic AcidSignal Ampli

2、fication Strategy in BiosensorsAbstract： Rolling circle amplification (RCA) is an isothermal nucleic acid amplification technique. Due to its high efficiency and high fidelityc this technique has been widely used in biosensors. This review introduces the principle of RCA technique c the common cycli

3、zation types of RCA template and the common types of RCA, as well as the fluorescentc colorimetric and electrochemical biosensors based on RCA. The aim of this review is to provide references for the further development and application of the RCA technique in biosensors.Key words: isothermal nucleic

4、 acid amplification : rolling circle amplification : biosensor近年來(lái)，基于分子生物學(xué)的檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域，其中包括PCR （Polymerase chain reaction）技術(shù)、滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）技術(shù)、 重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）技術(shù)和鏈置換擴(kuò)增（SDA）技術(shù)等。RCA作為一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，因其具 有高效、高保真性、高靈敏度以及能夠與各種常見信號(hào)輸出方法相結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)得到了較多關(guān)注，并在 單核昔酸多態(tài)性（SNP） 1、microRNAs （miRNAs

5、） 2、酶活性以及病原微生物項(xiàng)檢測(cè)等領(lǐng)域有著廣 泛應(yīng)用同。本文重點(diǎn)闡述了基于RCA結(jié)合熒光、比色以及電化學(xué)信號(hào)輸出方式的傳感器在生物檢測(cè)中 的應(yīng)用，綜述了 RCA技術(shù)在生物傳感器領(lǐng)域的研究和應(yīng)用進(jìn)展，并對(duì)其存在的問(wèn)題和發(fā)展前景進(jìn)行了 展望。1 RCA技術(shù)的原理及類型1. 1 RCA技術(shù)的原理自然界中，某些生物（如細(xì)菌、噬菌體等）體內(nèi)會(huì)發(fā)生環(huán)狀DNA或RNA分子的滾環(huán)復(fù)制過(guò)程，以 此獲得相應(yīng)的DNA或RNA拷貝，RCA就是借鑒這種滾環(huán)擴(kuò)增方式發(fā)展的一種體外等溫核酸擴(kuò)增技 術(shù)ercA技術(shù)始于上世紀(jì)90年代中期，5有研究表明，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下, 約幾十個(gè)堿基的單鏈環(huán)狀DNA分子可

6、作為DNA合成的模板，產(chǎn)生與環(huán)狀模板互補(bǔ)的具有重復(fù)串聯(lián)序 列的單鏈DNA分子，產(chǎn)物大小約數(shù)百至數(shù)萬(wàn)堿基，長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)百納米至微米之間，證實(shí)了滾環(huán)擴(kuò)增在 體外發(fā)生的可行性囪。RCA反應(yīng)需要4個(gè)組分：環(huán)狀DNA模(，稱為RCA模(；與RCA模板部 分互補(bǔ)的DNA/RNA引發(fā)鏈；具有鏈置換活性的DNA/RNA聚合酶(如Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA 聚合酶、Vent /go-DNA聚合酶和T7 RNA聚合酶)；脫氧核糖核Z三磷酸(dNTPs)。RCA模板通常是 一條15 200個(gè)堿基的單鏈DNA分子，在DNA連接酶(如T4 DNA連接酶)Taq DNA連接酶)和一條 與模板的5端和3端部分互

7、補(bǔ)的單鏈引物的作用下，模(DNA/5磷酸端(5-P)與3羥基端(3- OH)連接環(huán)化，以形成的環(huán)狀模板用于后續(xù)擴(kuò)增#5。環(huán)狀模板的擴(kuò)增依賴于具有鏈置換和持續(xù)合成活 性的DNA聚合酶，以Phi29 DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶最為常用。其中，Phi29 DNA聚合酶來(lái)源于 枯草芽泡桿菌(Bacillus subtilis)噬菌體phi29，其相對(duì)分子質(zhì)量為66 kDa#10。在其最適溫度30 l左右， Phi29 DNA聚合酶具有強(qiáng)大的5-3聚合活性和3$5外切酶活性，在20 min內(nèi)可產(chǎn)生大于70 kbp的 擴(kuò)增子，其擴(kuò)增靈敏度可達(dá)到單分子拷貝，且由于其具有3-5外切酶活性，能夠?qū)铣傻?/p>

8、單鏈序列 進(jìn)行校對(duì)，保真度較高11 y Bst DNA聚合酶編碼基因含有來(lái)自嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearother- mophilus) DNA聚合酶的基因和外源的麥芽糖結(jié)合蛋白(Maltoes_binding protein， MBP)基因，通過(guò)體外 表達(dá)得到具有5-3聚合活性，但無(wú)3-5外切酶活性的Bst DNA聚合酶#12$。相比于Phi29 DNA聚合 酶，Bst DNA聚合酶具有更高的熱穩(wěn)定性和更強(qiáng)的持續(xù)合成能力同樣被廣泛應(yīng)用于LAMP和RCA實(shí)驗(yàn)， 但因?yàn)槿狈?-5外切酶活性，其保真度較Phi29 DNA聚合酶略低。1.2 RCA技術(shù)的類型在進(jìn)行RCA實(shí)驗(yàn)之前，通

9、常需要先獲得一條環(huán)狀的RCA模(。根據(jù)RCA模板環(huán)化方式的不同， 可將其分為鎖式DNA(Padlock DNA)環(huán)化、啞鈴DNA (Dumbbell DNA)環(huán)化以及類啞鈴DNA (Dumbbelllike DNA)環(huán)化3種類型(如圖1A)13-14 y通過(guò)在一條DNA鏈)兩條DNA鏈內(nèi)形成局部雙鏈的結(jié)構(gòu)， 在T4 DNA連接酶)Taq DNA連接酶的作用下催化連接雙鏈DNA中單鏈切口的5和3兩末端，或者 催化連接兩條雙鏈DNA片段的5和3兩末端，形成環(huán)狀的DNA分子#15。在RCA實(shí)驗(yàn)中，RCA模( 的環(huán)化是進(jìn)行后續(xù)RCA的重要步驟，通過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)，RCA體系中的環(huán)化步驟能夠作為識(shí)別組件，實(shí)現(xiàn)

10、 對(duì)目標(biāo)物的特異性識(shí)別。圖1常見RCA模板環(huán)化方式及RCA擴(kuò)增方式Fig. 1 Common circularization and amplification methods of RCAA: common circularization methods of RCA， (1) padlock DNA; (2) dumbbell DNA; (3) dumbbell-like DNA. B : common amplification methods of RCA， (a) single-primer RCA; (2) multi-primers RCA; (c) exponential RC

11、A. C : signal output step of RCA， SG dye = SYBR Green dye (A:常見RCA模板環(huán)化方式，(1)鎖式DNA環(huán)化；(2)啞鈴DNA環(huán)化；(3)類啞鈴DNA環(huán)化。B:常見RCA擴(kuò)增方式，(a)單引物RCA; (b)多引物RCA; (c)指數(shù)RCA。C: RCA實(shí)驗(yàn)的信號(hào)輸出步驟，SG dye = SYBR Green dye)RCA技術(shù)可大致分為單引物RCA ( Single-primer RCA)、多引物RCA ( Multiprimers RCA)和指數(shù) RCA(Exponential RCA)，如圖1B。單引物RCA也稱線性RCA，是指

12、單一引物作為引發(fā)鏈，在具有鏈 置換活性的DNA聚合酶的作用下，引發(fā)鏈沿環(huán)狀的RCA模板延伸，上游產(chǎn)物則在延伸過(guò)程中被反復(fù) 置換，以此產(chǎn)生與模板互補(bǔ)的具有串聯(lián)重復(fù)序列的單鏈DNA分子#6。這種延伸在dNTPs充足的條件下 可以不斷進(jìn)行，產(chǎn)生長(zhǎng)度是模板幾百或幾千倍的單鏈DNA拷貝#16$。多引物RCA則是在線性RCA原理 的基礎(chǔ)上，額外加入一條)多條僅與環(huán)狀模板序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈引物作為引發(fā)鏈，即在滾環(huán)擴(kuò)增 反應(yīng)中，環(huán)狀模板可與多對(duì)引物結(jié)合進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物被DNA聚合酶不斷置換，產(chǎn)生多條RCA產(chǎn) 物，提高了環(huán)狀模板的利用效率，其擴(kuò)增效率是線性RCA的數(shù)倍指數(shù)RCA,也稱超分支RCA (Hype

13、rbranched rolling circle amplification， HRCA)，指通過(guò)在線性RCA體系中額外加入多對(duì)引物，這 些引物既能和線性RCA產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)合并延伸，延伸得到的DNA鏈又可與另一條次級(jí)引物結(jié)合，實(shí)現(xiàn) 指數(shù)擴(kuò)增，產(chǎn)生大量長(zhǎng)短不一的單鏈及雙鏈產(chǎn)物，擴(kuò)增效率大大提高，因此被廣泛應(yīng)用于各種對(duì)靈敏 度要求較高的檢測(cè)傳感器區(qū)切。圖1C為RCA信號(hào)的輸出方式示例。2基于RCA的生物傳感器在生物檢測(cè)中的應(yīng)用RCA技術(shù)因其擴(kuò)增快速、模板序列可設(shè)計(jì)、擴(kuò)增子分子量大以及保真度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于 DNA克隆、基因組分析、DNA納米結(jié)構(gòu)構(gòu)建以及生物傳感器等領(lǐng)域昭。本文重點(diǎn)介紹基于RCA

14、的生 物傳感器在生物檢測(cè)中的應(yīng)用。RCA作為一種信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)，可與多種信號(hào)輸出方式相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì) 待檢物的熒光、比色)電化學(xué)檢測(cè)。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室探討并建立了基于RCA的熒光及比色傳 感器用于檢測(cè)食源性致病菌1920，所研究的傳感器利用不對(duì)稱PCR( Asymmetric PCR)或核酸適配子實(shí) 現(xiàn)了 “菌體-單鏈DNA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并利用RCA產(chǎn)物形成能夠與特異性染料結(jié)合的DNA二級(jí)結(jié) 構(gòu)，所設(shè)計(jì)的兩種傳感器具有信噪比高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)食源性致病菌的快速靈敏檢測(cè)。 近年文獻(xiàn)報(bào)道的基于RCA介導(dǎo)的核酸信號(hào)放大策略在生物傳感器中的應(yīng)用總結(jié)于表1。表1 RCA介導(dǎo)的核酸信號(hào)放大策略在

15、生物傳感器中的應(yīng)用Table 1 Application of the biosensors based on RCA nucleic acid signal amplification strategy in biological detectionDetection methodTargetLinear rangeLimit of detectionReferenceFluorescent sensorsSingle-base mutation0. 1 40 nmol/L0. 05 nmol /L#1$HeLa cells1 100 cellsSingle cellListeria mon

16、ocytogenes4. 8X101 4. 8x107 CFU/mL4. & X101 CFU/mL#14$Ribonuclease H01 U/mL0.019 U/mL21:Cardiac troponin I protein50 500 pg/mL14. 40 pg/mL#22$Cronobacter spp.4.3x1014.3x106 CFU/mL4.3 X101 CFU/mL#19$Colorimetric sensorsH5N1 influenza virus0.61 7&. 1 nmol/L3. 3 pmol /L#23 $Listeria monocytogenes4.6x10

17、24.6x107 CFU/mL4.6n102 CFU/mL#20 $Anti-hepatitis C virus antibody5 pmol/L50 nmol/L0. 998 pmol/L#24 $Tumor cells10 3n104 cells10 cells / mL#25 $microRNA0. 3 -300 pmol/L0. 3 pmol /L#26 $Listeria monocytogenes/2. 8n100 CFU/g#27 $Mercury ions0. 005 1. 0 nmol/L3. 7 pmol /L#28 $Electrochemical sensorsBrea

18、st cancer cell MCF 一 75 3n104 cells/mL1 cell /mL#29 $miRNA-2150 amol/L100 fmol/L8. 6 amol /L#30$Single-strand DNA1. 0 fmol/L1. 0 nmol/L0.28 fmol/L#31$Lipopolysaccharide0. 01 pg/mL100 ng/mL4. 8 fg/mL#32$Transgenic soybean DNA1 x10-161 n10-7 mol/L4.5 X10-17 mol/L#33$miRNA1. 0 fmol/L1. 0 nmol/L0.32 fmo

19、l/L#34$2. 1基于RCA的熒光生物傳感器熒光生物傳感器借助于熒光的增強(qiáng)、猝滅或者發(fā)射波長(zhǎng)的移動(dòng)實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光物質(zhì)的檢測(cè)。RCA產(chǎn)物 (單鏈)雙鏈DNA)可以與各種核酸熒光染料(SYBR Green I、SYBR Green 等)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn) 物的實(shí)時(shí)或終點(diǎn)檢測(cè)。基于RCA的熒光生物傳感器具有靈敏度高的特點(diǎn)，但由于熒光易被猝滅的特性 以及需要昂貴的檢測(cè)儀器，該技術(shù)并不利于即時(shí)檢測(cè)(Pointpfvare testing, POCT)。Li等采用鎖式探 針對(duì)待檢DNA單鏈進(jìn)行特異性識(shí)別，預(yù)先設(shè)計(jì)的鎖式探針能與含有突變堿基的DNA單鏈特異性結(jié)合 并在連接酶的作用下環(huán)化，投入的RCA引物可與

20、得到的環(huán)狀模板結(jié)合，發(fā)生RCA。通過(guò)投入SYBR Green I對(duì)RCA的雙鏈產(chǎn)物進(jìn)行染色，實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢物的熒光檢測(cè)，其檢測(cè)限為0. 05 nmol/L。該方法 利用鎖式探針實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的特異性識(shí)別，再引入RCA對(duì)信號(hào)進(jìn)行放大，只需熒光讀數(shù)儀既可實(shí)現(xiàn)信號(hào) 的讀取?；阪滙w(G-quadruplexes)結(jié)構(gòu)的RCA實(shí)驗(yàn)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、信噪比高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng) 用于各類RCA實(shí)驗(yàn)。Li等建立了一種檢測(cè)端粒酶的熒光傳感器，該傳感器利用端粒酶能夠延伸特定 堿基序列的特性，設(shè)計(jì)了相應(yīng)的端粒酶引物和鎖式探針。當(dāng)待檢物端粒酶存在時(shí)，鎖式探針的環(huán)化和 后續(xù)的RCA才能成功進(jìn)行，在RCA產(chǎn)物上形成大量重復(fù)的G也鏈體

21、結(jié)構(gòu)，體系內(nèi)的Thioflavin T能夠 與G也鏈體特異性識(shí)別并使得自身熒光大大增強(qiáng)，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢物的熒光檢測(cè)，該方法的檢測(cè)限達(dá) 到了單細(xì)胞水平。Lee等盆設(shè)計(jì)了一種基于環(huán)狀探針和DNA/RNA復(fù)合引物檢測(cè)核糖核酸酶H (Ribonuclease H)的傳感器，核糖核酸酶H能夠特異性識(shí)別并水解復(fù)合引物中氨基修飾的RNA序列，從而暴 露出引物3羥基端，使得引物能夠引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增，該方法的檢測(cè)限為0.019 U/mL,線性范圍為01 U/mL,檢測(cè)時(shí)間5 min。本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了一種基于RCA/PCR - RCA熒光傳感器用于檢測(cè)克羅諾桿 菌屬#19$，采用不對(duì)稱加尾PCR從克羅諾桿菌屬基因組DN

22、A中擴(kuò)增得到帶有聚胸腺啥嚏(Poly-T)尾巴 的單鏈DNA,再投入預(yù)先成環(huán)的啞鈴DNA,帶尾的單鏈DNA能夠與啞鈴DNA結(jié)合，引發(fā)RCA，在 RCA產(chǎn)物上形成大量重復(fù)的G-l鏈體結(jié)構(gòu)，通過(guò)投入ThT與G-l鏈體結(jié)合，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)克羅諾桿菌屬 的熒光檢測(cè)。該方法在純培養(yǎng)液中對(duì)克羅諾桿菌屬的檢測(cè)限為4.3 X101 CFU/mL，線性范圍為4.3 n 101 4. 3x106 CFU/mL，相比于直接采用非特異性的SYBR Green染料對(duì)RCA產(chǎn)物進(jìn)行染色的方法， 該方法的信噪比較高，檢測(cè)靈敏度得到了提高。2.2基于RCA的比色生物傳感器比色生物傳感器信號(hào)來(lái)源于體系顏色的變化，與熒光傳感器相比，

23、比色傳感器無(wú)需或只需較為簡(jiǎn) 便的儀器即可實(shí)現(xiàn)信號(hào)讀取，因此廣泛應(yīng)用于即時(shí)或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。但比色生物傳感器由于顏色讀取易受 到基質(zhì)干擾，其靈敏度相較于熒光生物傳感器略低。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了一種基于RCA和 適配子的半固相比色傳感器談，該方法采用ELISA與RCA相結(jié)合，通過(guò)適配子特異性識(shí)別并結(jié)合待 檢物單增李斯特菌細(xì)胞，暴露出來(lái)的單鏈DNA能夠與環(huán)狀探針特異性結(jié)合并發(fā)生RCA，得到大量能夠 與修飾有辣根過(guò)氧化物激酶(Horseradish peroxidase， HRP)的DNA探針互補(bǔ)配對(duì)的結(jié)合位點(diǎn)，HRP催 化體系中的TMB (3，3，5，5-Tetramethylbenzidine)

24、發(fā)生顯色反應(yīng)，通過(guò)裸眼或吸光度可測(cè)定相應(yīng)的 比色結(jié)果。該方法利用了 RCA原位生長(zhǎng)的特點(diǎn)與ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)合，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu) 點(diǎn)，其在純培養(yǎng)液中的檢測(cè)限為4. 6 X102 CFU/mLy Hamidi等芝建立了一種基于RCA/pH響應(yīng)的比 色傳感器。由于RCA體系中的dNTP會(huì)隨擴(kuò)增不斷釋放產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物Hu，通過(guò)向體系中加入pH 指示劑酚紅，可指示其是否發(fā)生RCA，實(shí)現(xiàn)裸眼檢測(cè)。利用該方法對(duì)流感病毒H5N1進(jìn)行檢測(cè)，得到 的檢測(cè)限為3. 3 pmol/L，檢測(cè)時(shí)間僅需20 min。該實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中有較好 的應(yīng)用前景。Gao等萌通過(guò)在丙肝病毒抗體上修飾

25、DNA單鏈作為引發(fā)RCA的引物，得到的RCA產(chǎn)物 形成大量G-l鏈體結(jié)構(gòu)，體系中的Hemin與G-l鏈體形成具有催化活性的復(fù)合物，催化TMB顯色， 實(shí)現(xiàn)比色檢測(cè)，其裸眼檢測(cè)限為0. 998 pmol/L。該方法利用DNA修飾的抗體，實(shí)現(xiàn)了 “病毒衣殼-單 鏈DNA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)單鏈DNA引發(fā)RCA實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，具有較好的實(shí)際應(yīng)用前景。Hu等#26 利用金納米粒子聚集變色的原理，設(shè)計(jì)了一條鎖式探針與目標(biāo)miRNA進(jìn)行特異性識(shí)別并環(huán)化，環(huán)化的 探針隨后發(fā)生RCA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)的單鏈RCA產(chǎn)物，金納米探針上修飾的DNA鏈可與RCA產(chǎn)物互補(bǔ)配 對(duì)，從而拉近探針之間的距離，引起顏色變化。該方法對(duì)let

26、-7*的檢測(cè)限為0. 3 pmol/L，檢測(cè)線性范 圍為0. 3 300 pmol/Ly RCA擴(kuò)增產(chǎn)物既可與修飾有互補(bǔ)DNA的金納米探針結(jié)合，促進(jìn)金納米粒子的 聚集，也可作為單鏈DNA抑制高濃度鹽離子環(huán)境下金納米粒子的聚集。2.3基于RCA的電化學(xué)生物傳感器電化學(xué)生物傳感器是一種將生物敏感元件如DNA#蛋白質(zhì)等與電化學(xué)換能器相結(jié)合的分析裝置， 具有操作簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)。RCA因其原位擴(kuò)增的特點(diǎn)，相較于其他分子擴(kuò)增技 術(shù)更適合應(yīng)用在基于半固相或;相載體的檢測(cè)傳感器中。Shen等#29$采用適配子結(jié)合被抗體捕獲的循環(huán) 腫瘤細(xì)胞并引發(fā)RCA，形成的大量DNA分子與酸鹽反應(yīng)生成氧化

27、磷，并產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，該方法 的檢測(cè)限達(dá)到了單細(xì)胞水平，檢測(cè)線性范圍為53 X104 cells/mLo Zhang等#30$建立了一種基于RCA介 導(dǎo)的納米(化學(xué)傳感器用于檢測(cè)miRNA，RCA產(chǎn)生的富G序列單鏈能夠作為模板介導(dǎo)納米粒子的 原位合成，從而產(chǎn)生電信號(hào)，應(yīng)用該方法檢測(cè)miRNA - 21的檢測(cè)限為8. 6 amol/L，線性范圍為50 amol/L100 fmol/L。該方法利用RCA原位生長(zhǎng)的特點(diǎn)，以RCA產(chǎn)物為模板實(shí)現(xiàn)了納米粒子的原位 合成，其電信號(hào)得到了顯著增強(qiáng)。RCA技術(shù)具有模板可設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)，少量的RCA模板通過(guò)擴(kuò)增可以得 到大量具有特定功能的DNA序列，體現(xiàn)了 RCA技術(shù)的簡(jiǎn)便性。Wang等#口利用RCA產(chǎn)生大量具有催 化活性的DNA walker酶，通過(guò)酶的催化剪切作用釋放金電極表面的信號(hào)分子，從而實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號(hào)輸 出，該方法的檢測(cè)限達(dá)0. 28 fmol/L,檢測(cè)線性范圍為1.0 fmol/L1.0 nmol/Lo Xie閔等通過(guò)在金電極 上修飾適配子實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物脂多糖的特異性識(shí)別，再通過(guò)投入負(fù)載有適配子和RCA引物的金納米粒子 與識(shí)別的脂多糖形