酸性稻田土n-damo細(xì)菌的多樣性和豐度

1、酸性稻田土 n - damo細(xì)菌的多樣性和豐度摘要：亞硝酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化(n-damo)細(xì)菌是新近發(fā)現(xiàn)的一類具有特殊功能的微生物，在廢水深度脫 氮領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用前景。研究利用n-damo菌16S rRNA和pmoA基因的專一性引物，通過系統(tǒng)發(fā)育分析和定量PCR 技術(shù)，檢測酸性稻田土中該類群的多樣性和豐度。結(jié)果顯示，在弱酸性中等養(yǎng)分水平的稻田土中，n-damo菌聚為3 4 個OTU?類群；系統(tǒng)發(fā)育分析表明，酸性稻田土中存在新型未知n-damo類群；n-damo細(xì)菌豐度較高，16S rRNA基因 拷貝數(shù)可達(dá)1.25 - 2.31 X108拷貝每克干重，pm-A基因拷貝數(shù)為8. 66 x 1

2、06 2.54 X107拷貝每克干重。研究為后 續(xù)富集培養(yǎng)嗜酸型n-damo菌提供可靠菌源。關(guān)鍵詞：亞硝酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化細(xì)菌；酸性稻田土；系統(tǒng)發(fā)育分析；定量PCR0引言亞硝酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化(nitrite -dependent anaerobic methane oxidation， n - damo) 是 由一類特殊功能菌介導(dǎo)完成、在厭氧條件下耦合 甲烷氧化與亞硝酸鹽還原的酶促反應(yīng)過程12! Ettwig等通過厭氧富集培養(yǎng)和宏基因組學(xué)技術(shù)手 段，在河流底泥中檢測到n-damo功能菌的存在， 并命名為 Candidatus Methylomirabilis oxyfera ( M.

3、 oxyfera 3-5。該類菌在厭氧條件下，通過新型 胞內(nèi)自產(chǎn)氧途徑氧化甲烷，并獲取生長代謝的能 量。甲烷單加氧酶是甲烷氧化代謝途徑的關(guān)鍵 酶，編碼甲烷單加氧酶a亞基的pmoA基因可作 為鑒定n-damo細(xì)菌的遺傳分子標(biāo)記。在污水厭氧生物處理領(lǐng)域，存在厭氧段溫室 氣體甲烷無序排放、出水總氮不達(dá)標(biāo)等問題，限 制了厭氧技術(shù)在水處理領(lǐng)域的大規(guī)模推廣應(yīng)用。 N-damo過程可利用原位產(chǎn)生的甲烷進行脫氮, 無需外源添加其他碳源，同時實現(xiàn)溫室氣體的減 排和出水總氮的達(dá)標(biāo)，是兼具環(huán)境友好型和經(jīng)濟 節(jié)約型的新型脫氮工藝，具有潛在應(yīng)用 前景近年來，越來越多研究證實n-damo功能菌 在自然界中分布廣泛，河流底

4、泥、濕地、河口沉 積物、淹水稻田土、剩余污泥等生態(tài)系統(tǒng)中均不 同程度檢測到n-damo細(xì)菌的存在項-,但鮮有 研究報道酸性環(huán)境中該類菌的賦存情況。此外， n-damo細(xì)菌生長代謝速率低、代時長，富集培 養(yǎng)耗時久，限制了 n-damo在實際污水處理中的 推廣應(yīng)用區(qū)。因此，從其他生境中尋找更多n- damo菌源進行富集培養(yǎng)馴化是未來該領(lǐng)域發(fā)展的 重要方向之一，也是突破應(yīng)用瓶頸的關(guān)鍵所在?；诖?，本研究重點關(guān)注酸性厭氧生境典型 代表一發(fā)育自酸性紅壤的淹水稻田土，借助微 生物分子生態(tài)學(xué)檢測手段，解析其中n-damo細(xì) 菌的多樣性和豐度，以期為后續(xù)的富集培養(yǎng)研究 提供菌源。1材料與方法1.1 土樣的采集

5、及理化性質(zhì)的測定本研究選取四川眉山（經(jīng)緯度：E 10314 20； %45。5,58.87）稻田土作為研究對象，采 用五點隨機采樣法采集三塊不同點位的稻田土壤 樣品（分別命名為MS-I, MS-II和MS-III）采 樣時間為2019年6月，正值水稻種植晚期，稻 田為淹水狀態(tài)，自水土交界面向下延伸20 cm采 集表層土樣。采集的土樣經(jīng)充分混勻后，無菌條 件下，取0. 5 g置于2 mL bead - beating離心管 中，低溫運輸至實驗室，-800保存，用于后續(xù) 分子生物學(xué)檢測。剩余土樣風(fēng)干后，剔除植物殘 體、石礫，研磨過篩，常溫保存，用于土壤理化 性質(zhì)的測定。土壤有機質(zhì)和全氮含量采用國家

6、標(biāo) 準(zhǔn)檢測方法（GB9848 -44 和 HJ-717-2014）進 行測定，土壤分別用去離子水和1 mol/L KC1浸 提后，采用酸度計（雷磁，PHS - 25）測定 pH值。1.2 土樣核酸DNA的提取采用土壤核酸提取試劑盒（MP FastDNA! Spin Kit for Soil），參照試劑盒方法說明書，提取 土壤樣品的核酸DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電 泳，檢測土樣DNA的提取情況，采用超微量分 光光度計（Biofuture，MD2000D）測定核酸濃度 和純度。1. 3 基于n -damo細(xì)菌16S rRNA基因和pmoA 基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和克隆測序以1.2提取的DNA為模板，

7、采用巢式聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （nested - polymerase chain reaction， nested -PCR）擴增樣品中n - damo細(xì)菌的16S rRNA基因和pmoA基因，PCR擴增引物參見表 1；采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生 化）純化目標(biāo)基因的擴增產(chǎn)物；利用DNA T4連 接酶將純化后的目標(biāo)基因連接至PMD19-T質(zhì)粒; 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞 中，利用藍(lán)白斑篩選，得到含有目標(biāo)基因的陽性 克隆子；分別隨機挑選30個含有n-damo細(xì)菌 16S rRNA基因和pmoA基因的陽性克隆子，送樣 至上海生工測序平臺進行一代Sanger法測序。表1

8、本研究所涉及的引物具體信息Table 1 Detail Information of Primers in the Study引物名稱引物序列靶基因用途參考文獻(xiàn)202FGACCAAAGGGGn-damo - specificn-damo 16S rRNA基因巢式PCR第一段4GCGAGCG16S rRNA擴增的正向引物1545RCAKAAAGGAGGGeneral bacterialn-damo 16S rRNA基因巢式PCR第一段4TGATCC16S rRNA擴增的反向引物qPlFGGGCTTGACATCCCACGAACCTGn- damo- specific16S rRNAn-damo 1

9、6S rRNA基因巢式PCR第二段 擴增的正向引物；n-damo 16S rRNA基 因定量PCR正向引物4 續(xù)表引物名稱引物序列靶基因用途參考文獻(xiàn)qP2RCTCAGCGACTTCn-damo - specificn-damo 16S rRNA基因巢式PCR第二段4GAGTACAG16S rRNA擴增的反向引物qP1RCGCCTTCCTCCn- damo- specificn-damo 16S rRNA 基因定量 PCR 反4AGCTTGACGC16S rRNA向引物A189_ bGGNGACTGGGACTTYTGGGeneral bacterial pmoAn-damo pmoA基因巢式PC

10、R第一段擴增 的正向引物 6 cmo682AAAYCCGGCRAAGAACGAn- damo- specific pmoAn-damo pmoA基因巢式PCR第一段擴增 的反向引物 6 cmo182TCACGTTGACGCCGATCCn- damo- specific pmoAn-damo pmoA基因巢式PCR第二段擴增 和定量PCR的正向引物 6 cmo568GCACATACCCATCCCCATCn- damo- specific pmoAn-damo pmoA基因巢式PCR第二段擴增 和定量PCR的反向引物 6 1.4系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建將測序結(jié)果上傳至NCBI BLAST （ https:

11、 / blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi）,獲取相應(yīng)參比序 列，利用 MEGA 5. 0 軟件，經(jīng) Neighbor-joining 計算 方法比對建樹后，明確待測菌株的遺傳學(xué)分類。1. 5 基于n -damo細(xì)菌16S rRNA基因和pmoA 基因的定量PCR以1.2提取的DNA為模板，采用定量PCR 技術(shù)（quantitative polymerase chain reaction， qPCR）檢測樣品中n-damo細(xì)菌的豐度，qPCR 檢測試劑為 Power SYBR Green PCR Master Mix （Promega），檢測儀器為實時熒光

12、定量PCR儀 （ABI 7500），qPCR 引物詳見表 1。2結(jié)果與討論2.1眉山稻田土理化性質(zhì)分析本研究共采集3份土樣，去離子水浸提pH 值均小于6.0，1 mol/L KCl浸提pH值均小于 5.5,有機質(zhì)和總氮含量分別在20 30 g/kg和 1.02.0 g/kg范圍內(nèi)波動（表2） 0根據(jù)2015年 洪雅縣土肥站的土壤養(yǎng)分調(diào)研報告切，本研究 所涉及土樣均屬于微酸性中等養(yǎng)分水平土壤。已 知n-damo細(xì)菌在中性環(huán)境分布廣泛項-15，但鮮 有研究報道酸性環(huán)境中該類群的多樣性及豐度, 故解析酸性土樣中n-damo菌的賦存情況，對開 辟新的菌源意義重大。此外，尋找特殊生境條件 下的n-dam

13、o細(xì)菌，有助于富集培養(yǎng)具有獨特生 理代謝功能的微生物，例如嗜酸性的n-damo細(xì) 菌，用于低pH污水的深度脫氮處理。表2 土樣的基本理化性質(zhì)Table 2 Basic Physio-chemical Properties of Soil Samples土樣編號pH （去離子水浸提， 無量綱）pH （ 1 mol/L KCl 浸提， 無量綱）有機質(zhì)（g/kg）總氮（g/kg）MS-I5. 47 土 0. 324. 66 土 0. 3421. 12 土 1.001.16土 0. 05MS-II5. 74 土 0. 155. 28 土 0. 2622.01 土 1.281.32土 0. 12MS-I

14、II5. 66 土 0. 085. 25 土 0. 1821. 97 土 2. 061.25土 0. 042. 2 N-damo細(xì)菌的定性檢測和389 bp （ pm-!基因）“反。本研究成功擴增得根據(jù)文獻(xiàn)可知，巢式PCR第二段擴增反應(yīng)的到n-damo細(xì)菌特異性的16S rRNA基因和pmoA目標(biāo)基因長度分別為460 bp （ 16S rRNA基因） 基因，如圖1所示，泳道1、3和5為核酸DNA0.020.02Marker （ 100 bp ladder,自下而上依次為 100 bp 600 bp） , 2和4分別對應(yīng)n-damo細(xì)菌特異性 pmoA基因和16S rRNA基因片段，擴增條帶清

15、晰、亮度高、無非特異性擴增條帶、擴增長度與 文獻(xiàn)報道相吻合，可進行后續(xù)克隆測序分析。圖# n-damo細(xì)菌#6S nRNA和pmoA基因巢式PCR第二段擴增產(chǎn)物電泳圖譜Fig. 1 Electrophoretic Image of n-damo-specific16 S rRNA and pmoA Gene Fragment2-3酸性稻田土中n-damo細(xì)菌的多樣性本研究分別對n - damo細(xì)菌特異性的16S rRNA基因和pmoA基因進行系統(tǒng)發(fā)育分類鑒定， 以便更客觀準(zhǔn)確地反映n-damo細(xì)菌的多樣性賦 存情況。基于n-damo 16S rRNA和pmoA基因序 列相似度的聚類分析結(jié)果得出

16、，樣品中的n-damo 細(xì)菌分別聚為4和3個OTUs （ Operational taxonomic units,可操作分類單元），如圖2和圖3中 的紅色圓圈所示。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，本研究檢測到的n- damo 細(xì)菌位于 Candidatus Methylomirabilis oxyfera 系統(tǒng)發(fā)育分支，絕大多數(shù)酸性稻田土中的n- damo細(xì)菌與其它中性生境中檢測到的n-damo細(xì) 菌親緣關(guān)系較近。例如，圖2的OTU1與太湖底 泥環(huán)境樣品克隆子TH4-27相似度達(dá)98%以 上詢，其余OTUs與西溪濕地、紅樹林濕地沉積 物、黃河河口底泥、中性稻田土壤等環(huán)境樣品中 的n-damo細(xì)菌均具有較高的

17、相似度（圖2和圖 3）9-11。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，基于n-damo 16S rRNA和pmoA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果均指示， 酸性稻田土中存在未知OTU （圖2的OTU4和圖 3的OTU3），與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的序列均不匹配， 推測本研究土樣中可能含有獨特的n-damo細(xì)菌。 后續(xù)研究工作可增加樣本量，采集更多酸性環(huán)境 土壤樣本，以驗證本研究的檢測結(jié)果。 OTU1I Taihu lake sediment clone TH4-27 (JX235751)I- Xixi wetland clone XXB30-5 (KC905816)L Mangrove sediment clone MSN16S-2

18、 (KX511991)Estuarine and coastal sediments clone 16S-March-S05-34 (KX260605) |j.OTU2sH-Sludge enrichment clone Enr1-11 (KY078438)OTU3ion I Yellow river estuary sediment clone A49 (KP296954) .OTU4Candidatus Methylomirabilis oxyfera (FP565575) Candidatus Methylomirabilis sp. RS3 (KU891932)Desulfonauti

19、cus autotrophicus DSM 4206 (NR 044591)圖2 基于n-damo細(xì)菌16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic Tree Based on n-damo16S rRNA Gene基于n-damo pmoA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹樹根為 好氧甲烷氧化菌Methylomonas，從圖3可知，本 研究擴增所得pmoA基因序列全部歸屬于Candidatus Methylomirabilis oxyfera系統(tǒng)發(fā)育分支，未見 好氧甲烷氧化菌，證實了 cmol82-cmo586這對引 物的專一性，利用該引物對能夠靶向鑒定環(huán)境樣 品中n-damo厭氧甲烷

20、氧化菌的賦存情況囪。83 1eoTui Candidatus Methylomirabilis oxyfera (FP565575) |iSludge enrichment clone 1-4 (KY078446)1Enrichment clone RS1 (KT443986)*0.05 *Paddy field soil clone JYPS6-13 (KF546914) .OTU3 Methylomonas sp. LC 1 (DQ119046)圖3 基于n-damo細(xì)菌pmoA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic Tree Based onn- damo pmoA Ge

21、ne2- 4酸性稻田土中n-damo細(xì)菌的豐度本研究采用針對n-damo細(xì)菌16S rRNA基因 和pmoA基因的定量PCR，檢測酸性稻田土中n- damo細(xì)菌的豐度。研究共檢測了三塊樣田，MS- I、MS-II 和 MS-III 樣田中 n-damo 16S rRNA 基 因拷貝濃度分別可達(dá)1-25 x 108、2.31 x 108和 1- 34 x 108拷貝每克干重，pmoA基因拷貝濃度 分別為 8- 66 x 106、2- 54 x 107和 1.55 x 107 拷貝每克干重。其中，pmoA基因普遍比16S rRNA基因豐度低一個數(shù)量級，可能的原因在于n -damo細(xì)菌單個細(xì)胞中含有多個16S rRNA基因拷 貝，但通常pmoA基因為單拷貝。對比其他研究 發(fā)現(xiàn)，不同生境中的n-damo細(xì)菌16S rRNA基因 豐度值波動較大，其中，三峽江水水位波動帶最低，僅為4.70 X1Ocopies /g,長江河口