突變型與野生型TNF

1、突變型與野生型TNF【關(guān)鍵詞】,腫瘤ApptsisfturellsinduedbyutantandildtypeTNF【Abstrat】AI:Tparetheapptsisinduedabilityfrebinanthuanutanttype471rhTNF(t471rhTNF)iththatfildtyperhTNF(trhTNF)andtstudytheappttiehanisinduedbyt471rhTNF.ETHDS:TheapptsisfZR751ells,abreastanerellline,induedbyt471rhTNFrtrhTNFasanalyzedandparedby

2、20g/Lagarsegeleletrphresisandflytetrytehniques.TheativatinprfilesfnulearfatrNFBinZR751ellsuntreatedandtreatedbyt471rhTNFrtrhTNFeredetetedusingTransATNFBp65kitbasednELISAfrfurtherstudyftheappttiehanisinduedbyt471rhTNF.RESULTS:Theresultsfr20g/LagarsegeleletrphresisfgeniDNAindiatedthatZR751ellstreatedb

3、yt471rhTNFprvidedatypialappttiladderpatternfDNAfragentatin,hereaseakenedladderserebservedinZR751ellstreatedbytrhTNF.Flytetryshedthattheellappttirateint471rhTNFtreatedgrupas43%,but25%intrhTNFtreatedgrup.Thet471rhTNFheldastrngapptsisinduibleability.TheresultsfDNAbindingativityfNFBshedthatNFBativatinin

4、duedbytrhTNFassignifiantlyhigherthanthatft471rhTNFhentheprtEinnentratinft471rhTNFrtrhTNFreahed50g/L(P=0.002).NLUSIN:Theapptsisinduedabilityft471rhTNFissuperirtthatftrhTNF.nefthepssiblereasnsfrtheenhanedapptsisinduedabilityaybethatNFBativatinisinhibitedinturellstreateditht471rhTNF.【Keyrds】neplass;uta

5、nttype471rhTNF;ildtyperhTNF;NFkappaB;apptsis【摘要】目的：比擬重組人突變型471rhTNFt471rhTNF與野生型rhTNFtrhTNF誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的才能，并對(duì)t471rhTNF誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用機(jī)制進(jìn)展初步研究.方法：以乳腺癌細(xì)胞系ZR751細(xì)胞為靶細(xì)胞，應(yīng)用基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳及流式細(xì)胞技術(shù)分析t471rhTNF與trhTNF誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的情況；利用以ELISA為根底的TransATNFBp65試劑盒檢測(cè)經(jīng)t471rhTNF或trhTNF處理的ZR751細(xì)胞核因子NFB的活化情況，以便對(duì)其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制進(jìn)展初步的研究.

6、結(jié)果：20g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示，t471rhTNF處理組的ZR751細(xì)胞基因組DNA呈現(xiàn)明顯的ladder狀分布，trhTNF處理組的“l(fā)adder條帶明顯減弱；流式細(xì)胞儀分析顯示，t471rhTNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡峰面積高于trhTNF處理組.NFB活化檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)兩型rhTNF濃度增高到50g/L時(shí)，trhTNF處理組的NFB的活化量明顯高于同濃度的t471rhTNF處理組P=0.002.結(jié)論：t471rhTNF誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的才能明顯優(yōu)于trhTNF；腫瘤細(xì)胞內(nèi)NFB活化明顯受抑是t471rhTNF誘導(dǎo)凋亡才能增強(qiáng)的主要原因之一.【關(guān)鍵詞】腫瘤；突變型471rhTNF；野生型rh

7、TNF；NFB；細(xì)胞凋亡0引言人腫瘤壞死因子turnersisfatralpha,TNF，主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子.t471rhTNF是刪除tTNFN端的7個(gè)氨基酸，并將Pr8Ser9Asp10置換為Arg8Lys9Arg101的突變體.這種突變并不改變TNF分子的高級(jí)構(gòu)造，仍然形成具有生物活性狀態(tài)的三聚體，抗腫瘤作用增強(qiáng)且毒副作用降低，極具開發(fā)價(jià)值.我們?cè)讷@得t471rhTNF重組蛋白的根底上2-4，進(jìn)展新的研究，為t471rhTNF的臨床前研究提供實(shí)驗(yàn)根據(jù).1材料和方法1.1材料兩種基因工程蛋白在大腸桿菌DH5中進(jìn)展表達(dá)，初步檢測(cè)具有良好的生物學(xué)活性.乳腺癌細(xì)胞系

8、ZR751為本室保存.細(xì)胞培養(yǎng)基RPI1640系GIBBRL產(chǎn)品，F(xiàn)S購自杭州四季青生物技術(shù)公司.TransATNFBp65Kit由晶美生物工程提供.胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供.1.2方法1.2.1確定t471rhTNF與trhTNF濃度蛋白溶解液溶解冷凍枯燥蛋白，按1100稀釋，測(cè)定280n和260n下的A值，確定蛋白的濃度；另取10L加等體積2蛋白電泳載樣液，行150g/LSDSPAGE凝膠電泳，Bakan光密度掃描儀進(jìn)展薄層掃描，以確定目的蛋白的含量.1.2.2兩型rhTNF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡復(fù)蘇ZR751細(xì)胞，傳代培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，胰蛋白酶消化，Hanks液終止

9、消化，搜集細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2108/L.將細(xì)胞分為3組，即ZR751對(duì)照組、trhTNF和t471rhTNF處理組.培養(yǎng)基中放線菌素D的終濃度為0.5g/L，樣品終濃度為0.1g/L，于加藥后12h搜集細(xì)胞.將細(xì)胞分為兩局部，一局部用于20g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA，另一局部用于流式細(xì)胞分析，以PBS洗滌細(xì)胞，RNase降解RNA,700L/L乙醇固定，待用.檢測(cè)時(shí)，PBS洗滌以棄除700L/L乙醇，空干，碘化丙啶PI避光染色15in以上.PBS洗滌后，將細(xì)胞重新懸于1LPBS中，用EPISELITE,ULTER,USA型流式細(xì)胞儀分析比擬兩型TNF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況.1.2.3

10、核蛋白的提取并定量按1.2.2的處理方法復(fù)蘇并傳代ZR751細(xì)胞，但樣品終濃度分別為10g/L和50g/L，作用4h后搜集細(xì)胞，分別提取各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞核蛋白質(zhì)，操作按試劑盒說明書進(jìn)展，即：用PBS洗滌細(xì)胞，20L細(xì)胞沉淀參加200L細(xì)胞漿蛋白抽提試劑，振蕩5s將細(xì)胞沉淀充分懸浮，加細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B10L.高速振蕩5s，冰浴1in.4,1216kg,離心5in，汲取上清至預(yù)冷的塑料管中，即為細(xì)胞漿蛋白.在沉淀中參加50L細(xì)胞核蛋白抽提試劑，劇烈振蕩1530s，把沉淀完全懸浮.冰浴，每隔12in再高速劇烈振蕩1530s，共30in.4,1216kg,離心10in，汲取上清至預(yù)冷的塑料管中，即為

11、細(xì)胞核蛋白，紫外分光光度計(jì)下進(jìn)展蛋白定量，-70凍存.1.2.4基于ELISA法的NFB活性檢測(cè)操作按照TransATNFBp65試劑盒說明書進(jìn)展，簡介如下：參加3g的細(xì)胞核蛋白抽提物，室溫孵育1h，期間溫和搖動(dòng)96孔板，使之均勻地結(jié)合；用200L的洗滌buffer洗滌3次，參加100L以11000稀釋的NFB抗體，勿搖動(dòng)，室溫下孵育1h；用200L的洗滌buffer洗滌3次，參加100L以11000稀釋的辣根過氧化物酶聚合的二抗，室溫下孵育1h；用200L的洗滌buffer洗滌4次，室溫下每孔中參加100L的展呈液，及時(shí)觀察顏色的變化，直到培養(yǎng)基的顏色變?yōu)樯钏{(lán)色時(shí)參加100L的終止液，遇酸時(shí)

12、，藍(lán)色變?yōu)辄S色，測(cè)定450n下的A值.利用試劑盒中提供的突變寡核苷酸進(jìn)展NFB特異性結(jié)合為對(duì)照.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：以SPSS11.0軟件進(jìn)展統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩實(shí)驗(yàn)組NFB的活性檢測(cè)分析采用t檢驗(yàn)，P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.2結(jié)果2.1t471rhTNF與野生型rhTNF的濃度由兩樣品的SDSPAGE結(jié)果及Bakan光密度掃描儀薄層掃描結(jié)果可知，目的蛋白的純度為96.7%和93.1%；紫外分光光度法測(cè)定A280n和A260n吸光度值，可知trhTNF蛋白的產(chǎn)量為3.48g/L,t471rhTNF蛋白的產(chǎn)量為5.25g/L.2.2誘導(dǎo)ZR751細(xì)胞凋亡的檢測(cè)ZR751細(xì)胞在含有放線菌素D的培養(yǎng)液中，在t4

13、71rhTNF與trhTNF處理組中，分別參加10g/L的t471rhTNF與trhTNF，分別經(jīng)兩樣本作用12h后，進(jìn)展細(xì)胞基因組DNA20g/L瓊脂糖凝膠電泳.t471rhTNF組的細(xì)胞基因組DNA降解成不同倍數(shù)的180200bp大小的片段，呈現(xiàn)明顯的ladder狀分布Fig1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)ZR751細(xì)胞凋亡與對(duì)照組相比，雖然兩實(shí)驗(yàn)組均有凋亡峰出現(xiàn)，但t471rhTNF誘導(dǎo)的凋亡峰面積占43%，trhTNF誘導(dǎo)凋亡峰面積占25%,t471rhTNF誘導(dǎo)的凋亡峰面積高于同濃度trhTNF誘導(dǎo)組，對(duì)照組未見凋亡峰.2.4不同實(shí)驗(yàn)組ZR751中的NFB活性實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了不同的TNF濃

14、度處理ZR751細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知(n=3)當(dāng)兩型rhTNF以濃度為10g/L作用于ZR751細(xì)胞4h后，與對(duì)照組A均值0.60.03相比，trhTNF和t471rhTNF處理組的NFB活化均有增加，其A均值分別為1.350.1732和0.90.1,trhTNF處理組的NFB活化增加量高于t471rhTNF處理組t=7.68,P=0.002；當(dāng)兩型TNF濃度增高到50g/L時(shí)，trhTNF處理組的增加量明顯增多其A均值為(3.480.13)，而t471rhTNF處理組僅有輕度升高，A均值為(1.650.217)，兩實(shí)驗(yàn)組間有顯著差異t=12.49,P=0.000；當(dāng)樣品的濃度為100g/L時(shí)，

15、特別是t471rhTNF處理組的細(xì)胞有明顯的死亡，未見到明顯的NFB活性改變；此外，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組均未見到NFB活化量隨TNF作用時(shí)間的延長而增加，在一定濃度范圍的TNF作用下，細(xì)胞NFB的活化有劑量依賴性.3討論我們?cè)讷@得高純度和高活性t471rhTNF的根底上，對(duì)兩型TNF誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的才能及相關(guān)機(jī)制進(jìn)展了初步比擬研究.研究發(fā)現(xiàn)，t471rhTNF殺傷腫瘤細(xì)胞的作用是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡實(shí)現(xiàn)的，與trhTNF相比，t471rhTNF誘導(dǎo)ZR751細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用明顯增強(qiáng).分析t471rhTNF誘導(dǎo)凋亡才能增強(qiáng)的主要因素可能與以下因素有關(guān)：首先，TNF作用于不同亞型的受體TNFR1和T

16、NFR2可以激活不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑.已有的研究報(bào)道t471rhTNF由于在N端進(jìn)展了缺失突變和氨基酸置換，與TNFR1的親和力顯著進(jìn)步，對(duì)TNFR2的親和力降低1.存在于大局部細(xì)胞外表的TNFR1是一個(gè)含有死亡域deathdain的受體，接頭蛋白TNFR相關(guān)死亡域蛋白TRADD與TNFR1分子的胞內(nèi)死亡域局部相結(jié)合，而TRADD隨后又引起的另一個(gè)接頭蛋白Fas相關(guān)死亡域蛋白FADD的招募，因此形成了誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物，此復(fù)合物通過aspase8的活化啟動(dòng)了凋亡.其次，主要表達(dá)在髓性細(xì)胞和受刺激的T或B淋巴細(xì)胞外表的TNFR2，可以激活NFB，具有抗凋亡的作用并引起全身毒副作用5,6.為了

17、進(jìn)一步分析本實(shí)驗(yàn)中腫瘤細(xì)胞的凋亡是否與NFB的活化有關(guān)，我們采用TRANSANFB轉(zhuǎn)錄因子測(cè)定試劑盒，此法較凝膠分析更為靈敏，它是以ELISA為根底，將NFB的p65亞單位結(jié)合位點(diǎn)的共有序列，即5GGGATTT3包被于96孔板上，細(xì)胞核蛋白中轉(zhuǎn)錄因子NFB的活化形式可以與此寡核苷酸特異性結(jié)合，而識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子的一抗那么與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，再用抗IgG偶聯(lián)物和顯色反響，容易得到定量的結(jié)果.實(shí)驗(yàn)中，trhTNF處理組的NFB的活化量顯著高于t471rhTNF處理組，此結(jié)果證實(shí)了t471rhTNF與TNFR2的結(jié)合力降低，使NFkB的活化受到抑制這一設(shè)想.trhTNF在與TNFR1或TNFR2結(jié)合時(shí)并沒有

18、明顯的選擇性，它與受體結(jié)合后不僅介導(dǎo)凋亡信號(hào)的發(fā)生，同時(shí)也具有局部活化NFkB的作用，因此，trhTNF只可以引起細(xì)微的凋亡；而t471rhTNF與TNFR2的親和力降低，造成NFB的活化量明顯減少，引起大量的靶細(xì)胞發(fā)生凋亡，因此t471rhTNF可能具有更強(qiáng)的抗腫瘤作用.研究認(rèn)為，NFB是一種廣泛分布的多效性的核因子7,8，它可以調(diào)節(jié)一些編碼細(xì)胞因子、細(xì)胞黏附分子和生長因子的基因表達(dá)9，為大局部腫瘤細(xì)胞提供有重要意義的生存蛋白，如IAP家族、survivin蛋白等；激活凋亡抑制基因的轉(zhuǎn)錄，如y，D40L等，抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)其生存.目前，NFB已經(jīng)成為人們親密關(guān)注的抗癌藥物治療的靶點(diǎn)

19、.我們推測(cè)t471rhTNF是通過下調(diào)NFB的抑凋亡才能，而擁有了相對(duì)較強(qiáng)的抑制細(xì)胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的才能.值得注意的是細(xì)胞凋亡并不只是線性通路，而更可能存在凋亡信號(hào)分子互相影響的環(huán)性通路.尤其是半胱天冬氨酸酶、線粒體膜Bl2家族以及細(xì)胞色素間存在的互相作用，使得上游分子和下游分子的凋亡信號(hào)可以呈環(huán)形級(jí)聯(lián)放大，也可以由一些抑制凋亡的分子如Bl2等阻斷這種環(huán)形放大的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，從而有效地抑制凋亡10.因此，終究t471rhTNF是否存在其它誘導(dǎo)腫瘤凋亡的機(jī)制，有待于我們進(jìn)一步的研究.【參考文獻(xiàn)】1asegiT,KatA,KitaiK,etal.haraterizatinfanvelhua

20、nturnersisfatralphautantithinreasedyttxiativityJ.JpnJanerRes,1995;86(1):72-80.2李瑤琛，孔令洪，王一理，等.重組人突變型471TNF及野生型TNF的表達(dá)及活性初步鑒定J.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版,2022;24(1):14-16.LiY,KngLH,angYL,etal.Theexpressinfrebinanthuanutant471TNFandildtypeTNFandthepriaryidentifiatinfthEirbiativitiesJ.JXianJiatngUniv(edSi),2022;24(1):1

21、4-16.3孔令洪，李瑤琛，王一理，等.人突變型TNF工程菌發(fā)酵培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究J.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版,2022;24(3):211-214.KngLH,LiY,angYL,etal.StudynferentatinfrebinantbaterialstrainfhuanutantturnersisfatrJ.JXianJiatngUniv(edSi),2022;24(3):211-214.4李瑤琛，孔令洪，王一理，等.人重組TNF突變體471蛋白的初步純化及生物學(xué)活性J.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2022;19(4):409-412.LiY,KngLH,angYL,etal.StudynthepreliinarypurifiatinandbiativityfrebinanthuanTNF-utein471J.hinJelllIunl,2022;19(4):409-412.5LejeuneF,LienardD,EggerntA,etal.linialexperieneithhighdseturnersisfatralphainreginalt