基因工程-3章 基因工程載體課件

1、第三章 基因工程載體 一、概 述二、質(zhì)粒載體三、噬菌體載體四、酵母人工染色體載體2022/10/131一、概 述(一)基因載體的概念基因載體:是指運(yùn)載目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，使之能得到復(fù)制和進(jìn)行表達(dá)的工具, 化學(xué)本質(zhì)是DNA分子。按來源分:質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體、酵母人工染色體載體等。 按功能和用途分:克隆載體和表達(dá)載體，表達(dá)載體又分胞內(nèi)表達(dá)和分泌型表達(dá)載體。按性質(zhì)分：融合型載體、非融合型載體。按受體細(xì)胞:原核細(xì)胞載體和真核細(xì)胞載體。2022/10/132(二)基因載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力。為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。2022/1

2、0/133(三)基因載體具備的特性載體能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的DNA自我復(fù)制；或整合到染色體DNA上，隨著染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制；在載體中插入外源基因后，仍然保持穩(wěn)定的復(fù)制狀態(tài)和遺傳特性。載體易于從宿主細(xì)胞中分離，并進(jìn)行純化。載體都具有供外源基因插入的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)。載體都具有能夠觀察的表型特征(遺傳標(biāo)記基因)，在插入外源基因后可作為重組DNA選擇的標(biāo)志。2022/10/134載體本身分子量比較小,可容納較大外源基因片段。載體在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)高，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。載體在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。載體都是安全的，不含對(duì)受體細(xì)胞有害的

3、基因，并且不會(huì)任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其他生物細(xì)胞。2022/10/135(五)基因載體的致死效應(yīng)利用基因載體進(jìn)行基因克隆時(shí)，有時(shí)大量的克隆基因及其基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞是有害的，不利于宿主細(xì)胞的生長繁殖，甚至可使宿主細(xì)胞中毒死亡的現(xiàn)象。克服基因載體致死效應(yīng)的對(duì)策：使用嚴(yán)密型質(zhì)粒來分離、純化多拷貝的松弛型質(zhì)粒上大量表達(dá)時(shí),可呈現(xiàn)致死效應(yīng)的功能性基因,即用松弛型質(zhì)粒與嚴(yán)密型質(zhì)粒雜交改良。使用溫度敏感型載體。在較低溫度下，目的基因不表達(dá),宿主菌可自由生長；當(dāng)宿主菌增殖達(dá)到一定數(shù)量后,提高培養(yǎng)溫度,使目的基因大量表達(dá)。2022/10/137二、質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體是以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的基因載

4、體，主要用于原核生物和真核生物的基因轉(zhuǎn)移及建立基因組文庫和cDNA文庫。2022/10/1382022/10/13101.質(zhì)粒(plasmid )的概念： 獨(dú)立于染色體外能夠進(jìn)行自我復(fù)制的雙鏈DNA分子。質(zhì)粒分子成份：DNA、RNA。質(zhì)粒DNA的構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)狀(ccc-DNA)、開環(huán)(oc-DNA)和線性(l-DNA)構(gòu)型。 Plasmid chromosome ccc2.質(zhì)粒的生物學(xué)特性(1)質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài),但在一定地條件下又會(huì)可逆地整合到寄主染色體上,隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制。(2)質(zhì)粒DNA在添加真核復(fù)制信號(hào)和啟動(dòng)子后,可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中

5、均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。2022/10/13112022/10/1312(3)質(zhì)粒的拷貝數(shù): 是指每個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的數(shù)量。 根據(jù)每個(gè)宿主細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少,把質(zhì)粒分為嚴(yán)密型質(zhì)粒(拷貝數(shù)少,為1-5個(gè))與松弛型質(zhì)粒(拷貝數(shù)多,可達(dá)10-200個(gè)拷貝)；松弛型質(zhì)粒DNA的復(fù)制不受宿主菌蛋白合成的影響，即當(dāng)宿主菌蛋白合成受到抑制，而質(zhì)粒DNA復(fù)制可繼續(xù)進(jìn)行，由數(shù)十個(gè)增至數(shù)千個(gè)。因此,通常選用松弛型質(zhì)粒作為基因載體。(4)質(zhì)粒的不相容性(incompatibility,又稱質(zhì)粒的不親和性)：在沒有選擇壓力的調(diào)節(jié)下，兩種不同質(zhì)粒不能共存同一宿主細(xì)胞

6、內(nèi)的現(xiàn)象。4.質(zhì)粒的標(biāo)記基因(又稱報(bào)告基因)標(biāo)記基因按其用途分為2類：選擇標(biāo)記基因:用于鑒別目的載體的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來。篩選標(biāo)記基因:用于區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，可將攜帶了外源DNA片段的重組質(zhì)粒挑選出來。2022/10/13142022/10/13154.1 選擇標(biāo)記基因2022/10/1317抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法) (2)-互補(bǔ)(-complementation)是指-半乳糖苷酶基因(LacZ)上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的LacZ基因的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，從而產(chǎn)生具有-半乳糖苷酶活性的蛋白，這種現(xiàn)象就稱為-互補(bǔ)。2022/10/131

7、82022/10/13195.質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)基因工程載體含有一個(gè)人工合成的多種限制性內(nèi)切核酸酶的單一識(shí)別序列，稱為多克隆位點(diǎn)(multiple cloning site, MCS)。2022/10/13206.質(zhì)粒DNA的分離和純化方法眾多，主要依據(jù)： 1.分子大小不同 2.堿基組成不同 3.超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)不同常用方法：堿變性抽提法、煮沸法、去污劑(如Triton或SDS)裂解法、羧基磷灰石柱層析法、質(zhì)粒DNA釋放法等。2022/10/1321堿變性抽提法原理利用染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性存在著差異達(dá)到分離的目的。在pH達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺

8、旋結(jié)構(gòu)解開而變性；質(zhì)粒DNA的大多數(shù)氫鍵斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不能完全分離；用pH4.8的NaAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀除去，質(zhì)粒DNA則留在溶液中，因而提取到質(zhì)粒DNA。2022/10/13222022/10/1324pET28c(+)電泳結(jié)果 堿抽提法所用試劑的生化作用 所用的試劑：溶菌酶、LB培養(yǎng)基、葡萄糖/Tris/EDTA溶液(5Ommol/L葡萄糖；25mmol/L TrisHCl；pH8.0，lOm

9、mol/L EDTA)、TE緩沖液、 NaOH-SDS溶液、 3mol/L醋酸鉀溶液、異丙醇、100%乙醇和70%乙醇等。 2022/10/1325NaOH-SDS液: NaOH濃度為0.2 mol/L，加入抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH高達(dá)12.6，引起染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性。 SDS(十二烷基磺酸鈉)離子型表面活性劑，可溶解細(xì)胞膜脂質(zhì)與蛋白，破壞細(xì)胞膜； 解聚核蛋白，能與蛋白質(zhì)結(jié)合成R-O-S03-R+一蛋白質(zhì)復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性沉淀下來。2022/10/1327KAc: pH4.8 KAc溶液可將pHl2.6的抽提液調(diào)節(jié)至中性使變性質(zhì)粒DNA復(fù)性，并穩(wěn)定存在于溶液中。3mol/L高鹽KAc

10、染色體DNA變性、RNA、SDS-蛋白復(fù)合物凝聚沉淀。因?yàn)槿旧wDNA核酸上電荷被中和，減少斥力而互相聚合，鉀鹽與RNA、SDS-蛋白復(fù)合物作用，形成鉀鹽復(fù)合物，使沉淀更完全。 2022/10/1328無水乙醇: 沉淀DNA 優(yōu)點(diǎn)：具有很強(qiáng)的吸水性，可以任意比例和水相混溶，且乙醇與核酸不起任何反應(yīng)，對(duì)DNA很安全。 DNA溶液(DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在)，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇將奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而聚合。 2022/10/1329苯酚-氯仿溶液:苯酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水溶液與苯酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被苯酚或氯仿擠出，使蛋白質(zhì)失水而變性。

11、密度：苯酚-氯仿變性蛋白質(zhì)水相 離心：從上到下： 上層：水相； 中間：變性蛋白質(zhì)； 下層：苯酚-氯仿 使變性蛋白質(zhì)與水相中的DNA分開！2022/10/1330異戊醇: 降低分子表面張力，減少抽提過程中泡沫的產(chǎn)生。 此外，有助于相的穩(wěn)定。使離心后的上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。 2022/10/13317.常用質(zhì)粒載體2022/10/13322022/10/1333pBR322質(zhì)粒載體pBR322質(zhì)粒載體的組成含pSF2124質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子Tn3的氨芐青霉素抗性基因(ampr)含有pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因(tetr) ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)。20

12、22/10/1334pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)pBR322分子量較小,長度為4363bp的環(huán)狀雙鏈DNA。pBR322具有2種抗菌素抗性基因,抗四環(huán)素基因(tetr)和抗氨芐青霉素基因(ampr),可供作為選擇標(biāo)志。pBR322具有較高的拷貝數(shù),15-20個(gè)/細(xì)胞，為重組體DNA制備提供了極大方便。含有5個(gè)單一的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。 pBR322 DNA被限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段大小已知道，可作為核酸電泳的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。2022/10/13352022/10/1336pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板pUC質(zhì)粒載體pUC質(zhì)粒在pBR322基礎(chǔ)上改建的，其組成如下：含有p

13、BR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(ori)。含有氨芐青霉素抗性基因(ampr)基因。含有大腸桿菌-半乳糖酶基因(lacZ)的啟動(dòng)子及其編碼-肽鏈的DNA序列(即lacZ基因)。位于lacZ基因中靠近5端引入了一段有多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)段,但它不會(huì)引起編碼肽鏈功能的改變。2022/10/13372022/10/13382022/10/1339pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)，可達(dá)500-700個(gè)拷貝/細(xì)胞。適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體,有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補(bǔ)作用，在IPTG誘導(dǎo)和底物X-gal存在下，形成藍(lán)色和白色菌落篩選重組體。

14、具有多克隆位點(diǎn)，便于目的基因克隆。2022/10/13402022/10/1341T-載體8.質(zhì)粒載體的用途 用于保存和克隆小于2kb的目的基因。構(gòu)建基因組文庫和cDNA文庫?？捎糜谀康幕虻臏y(cè)序。作為核酸雜交時(shí)探針的來源。2022/10/13422022/10/13432022/10/13442022/10/1345 噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。三、噬菌體載體2022/10/1346噬菌體侵犯細(xì)菌時(shí)，只是

15、DNA侵入，然后利用細(xì)菌的酶來復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原兩種生活方式生存和繁殖。噬菌體在宿主內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，在1個(gè)菌體內(nèi)生長出100個(gè)左右的新噬菌體，并沖破（殺死）細(xì)菌釋放出來，再度感染其它活菌，稱為裂解。噬菌體侵入菌體后，把自身DNA加進(jìn)細(xì)菌DNA里（整合），作為細(xì)菌基因的一部分，隨菌的細(xì)胞分裂而增殖，這種生活狀態(tài)稱為溶原。2022/10/13472022/10/1348噬菌體的生活周期1.-DNA載體的構(gòu)建1.1 縮短長度 野生型-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆

16、粒。因此縮短野生型-DNA的長度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。2022/10/13491.2 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn) 野生型的-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1 - 2個(gè)；同時(shí)，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)；除了簡單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)。2022/10/13501.3 加裝選擇標(biāo)記 與質(zhì)粒不同，野生型-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容 -DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能

17、類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記2022/10/1351(1)加裝選擇標(biāo)記imm434 imm434基因編碼一種阻止-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。2022/10/1352(2)加裝選擇標(biāo)記lacZ lacZ基因編碼-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑。2022/10/13531.4 -DNA重組分子的體外包裝 -DNA重組分子需在體外人工包裝

18、成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。 用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，只有這兩部分包裝蛋白與重組-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的。2022/10/13541.5 -DNA及其重組分子的分離純化將大腸桿菌在含麥芽糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期加入噬菌體或重組噬菌體懸浮液，37培養(yǎng)1h用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12h。這時(shí)噬菌體顆粒密度已達(dá)1013 -1014

19、/L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放-DNA乙醇或異丙醇沉淀-DNA2022/10/13552.-DNA載體的主要類型插入型載體（insertion vector）: 通過特定的酶切位點(diǎn)允許外源DNA片段插入的載體。Charon2、Charon6、gt11置換型載體(replacement vector,又稱取代型載體):允許外源DNA片段替換非必需DNA片段的載體。EMBL4、gem-11、Charon402022/10/13562022/10/13572022/10/13583.-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌-DNA載體

20、的裝載能力為25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量重組-DNA分子的篩選較為方便重組-DNA分子的提取較為簡便-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因2022/10/1359四、酵母人工染色體載體人工染色體載體（artificial chromosome vector）:利用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù)制的載體。實(shí)際上是一種“穿梭”克隆載體，含有質(zhì)粒克隆載體所必備的第一受體(大腸桿菌)質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)(ori)，還含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。2022/10/1360這樣的克隆載體在第一受體細(xì)胞內(nèi)可以按質(zhì)粒復(fù)制形式進(jìn)入高拷貝復(fù)制。這種克隆載體在體外與目的DNA片段重組后，轉(zhuǎn)化第二受體細(xì)胞，可在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)按染色體DNA復(fù)制的形式進(jìn)行復(fù)制和傳遞。篩選第一受體的克隆子，一般采用抗菌素抗性選擇標(biāo)記；而篩選第二受體的克隆子，常用與受體互補(bǔ)的營養(yǎng)缺陷型。與其他的克隆載體相比，人工染色體克隆載體的特點(diǎn)是能容納長達(dá)1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。2022/10/1361(一)酵母人工染色