納米稀土熒光材料與時間分辨熒光免疫分析-硅膠包裹納米鋱熒

1、PAGE PAGE 11納米稀土熒光材料與時間分辨熒光免疫分析作 者：葉志強, 譚明乾 指導(dǎo)教師：袁景利, 王桂蘭一室1011組摘要：在油油包水型型的微乳乳液中，合合成了三三種形狀狀規(guī)則、尺尺寸均勻勻的硅膠膠基質(zhì)納納米稀土土熒光材材料。與與前驅(qū)體體相比，新新型熒光光納米微微粒具有有更強的的熒光強強度和抗抗光漂白白性能。將將納米微微粒表面面修飾并并標記鏈鏈酶親和和素SAA（或抗抗體）后后應(yīng)用于于時間分分辨熒光光免疫分分析，建建立了人人血清中中前列腺腺特異抗抗原（PPSA）、甲甲胎蛋白白（AFFP）和和乙肝表表面抗原原（HBBsAgg）的高高靈敏度度檢測方方法。關(guān)鍵詞：熒熒光納米米微粒；稀土配配合

2、物；生物標標記；時時間分辨辨熒光免免疫分析析。 時間分分辨熒光光生物分分析技術(shù)術(shù)是基于于稀土熒熒光化合合物特殊殊熒光性性質(zhì)而建建立起來來的一種種高靈敏敏度分析析方法，現(xiàn)已廣泛泛應(yīng)用于于免疫測測定、DDNA雜雜交測定定和熒光光顯微鏡鏡成像測測定等生生化檢測測的領(lǐng)域域1。該技技術(shù)利用用具有熒熒光壽命命長、SStokkes 位移大大和半峰峰寬窄等等特點的的稀土熒熒光配合合物作為為標記物物，不僅僅適用于于多標記記分析，而而且可完完全消除除各種散散亂光和和短壽命命熒光對對測定的的干擾，從從而實現(xiàn)現(xiàn)超高靈靈敏度分分析?；谶@些些優(yōu)點，時間分辨熒光生物分析技術(shù)在近20年來取得了重大的發(fā)展，在臨床醫(yī)學與生命

3、科學的實踐與研究中發(fā)揮著重要的作用。近年來，納納米尺度度發(fā)光材材料在生生化分析析領(lǐng)域中中的作用用受到了了越來越越多的關(guān)關(guān)注。量量子點22、膠體體金3、核殼殼型熒光光探針44等納米米顆粒作作為標記記物已經(jīng)經(jīng)開始應(yīng)應(yīng)用于生生化檢測測領(lǐng)域。但是由于納米尺度的發(fā)光粒子的瑞利、拉曼和丁達爾散射產(chǎn)生的背景光對測定的嚴重干擾,影響了檢測結(jié)果的靈敏度、精密度和準確度，無法實現(xiàn)高靈敏的定量分析。在我們的研研究中，綜綜合稀土土熒光標標記物和和納米技技術(shù)的優(yōu)優(yōu)勢，合合成了三三種具有有長壽命命熒光的的納米稀稀土熒光光微粒55-7。新新型納米米熒光微微粒用于于時間分分辨熒光光生物分分子分析析，不僅僅可從根根本上徹徹底消

4、除除各種散散亂光和和短壽命命熒光對對測定的的干擾，提提高分析析方法的的靈敏度度,而且且由于熒熒光配合合物被包包覆在硅硅膠的骨骨架結(jié)構(gòu)構(gòu)中,基基本隔絕絕了外部部環(huán)境對對配合物物的影響響，極大大地增強強了熒光光材料的的光穩(wěn)定定性。實驗部分1.摻雜型型納米熒熒光微粒粒的制備備將160mmg NN,N,N1,N1-22, 66-biis(33-amminoometthyll-1-pyyrazzolyyl)-pheenyll- ppyriidinnettetrrakiis(aacettatee)-Tbb3+（BBPTAA-Tbb3+）溶溶于1.1 mml的水水后和2200l的四四乙氧基基硅（TTEOSS

5、）攪拌拌下加入入到1000 mml的圓圓底燒瓶瓶中，然然后再分分別加入入2.337 gg Trritoon XX-1000、11.877 g 正己醇醇和7.25gg環(huán)己烷烷，制成成W/OO型微乳乳液，在在劇烈攪攪拌下向向其中加加入含有有2.337 gg Trritoon XX-1000、11.877 g正正己醇、77.255g環(huán)己己烷及2200l濃氨氨水的另另一種微微乳液。室室溫攪拌拌反應(yīng)224小時時后，加加入500 mll丙酮結(jié)結(jié)束反應(yīng)應(yīng)。將反反應(yīng)液離離心后除除去上清清液，沉沉淀部分分用乙醇醇和二次次蒸餾水水各洗三三次，真真空干燥燥后得到到白色硅硅膠包裹裹BPTTA-TTb3+納米熒熒光微粒

6、粒。2.摻雜型型納米熒熒光微粒粒用于測測定人血血清樣品品中的PPSA將含抗人PPSA單單克隆抗抗體（110 g/mml）的的pH值值為9.6的00.1 moll/L的的碳酸鈉鈉緩沖溶溶液500 l分注注于966微孔板板的各孔孔中，44 oC, 24小小時包被被后，將將PSAA標準溶溶液（用用5% BSAA-0.9% NaCCl-00.1% NaaN3的pHH值7.8的00.055 mool/LL Trris-HCll溶液制制備）或或血清樣樣品455 l注入入上述包包被后的的微孔板板中。337 00C，11小時反反應(yīng)后，用用含有00.055% TTweeen 220 的的pH值值7.88的0.0

7、5 moll/L Triis-HHCl緩緩沖溶液液（緩沖沖溶液11）洗兩兩次，再再用pHH值7.8的00.055 mool/LL Trris-HCll緩沖溶溶液（緩緩沖溶液液2）洗洗一次，然然后加入入45 l生物物素標記記的抗PPSA抗抗體溶液液，377 0C，11小時反反應(yīng)后，用用緩沖溶溶液1洗洗兩次，緩緩沖溶液液2洗一一次，再再加入445 l 納納米微粒粒標記的的SA溶溶液，337 00C，11小時反反應(yīng)后，用用緩沖溶溶液1洗洗4次，然然后進行行固相時時間分辨辨熒光測測定。 3.共聚合合型納米米熒光微微粒的制制備將160mmg BBPTAA-Tbb3+溶于11.1 ml的的水后和和2000

8、l的TTEOSS攪拌下下加入到到1000 mll的圓底底燒瓶中中，然后后再分別別加入22.377 g Triitonn X-1000、1.87 g正辛辛醇及77.255g環(huán)己己烷，制制成W/O型微微乳液，在在劇烈攪攪拌下向向其中加加入含有有2.337 gg Trritoon XX-1000、11.877 g正正辛醇、77.255g環(huán)己己烷及2200l濃氨氨水的另另一種微微乳液。室室溫攪拌拌反應(yīng)55小時后后，加入入6 l的33-22-(22-amminooethhylaaminno)eethyylamminooprropyyl- triimetthoxxysiilanne（AAEPSS），繼繼續(xù)

9、攪拌拌19小小時后，加加入500 mll丙酮結(jié)結(jié)束反應(yīng)應(yīng)。將反反應(yīng)液離離心后除除去上清清液，沉沉淀部分分用乙醇醇和二次次蒸餾水水分別洗洗三次，真真空干燥燥后得到到白色的的共聚合合型硅膠膠包裹BBPTAA-Tbb3+納米米熒光微微粒。4.共聚合合型熒光光納米微微粒用于于測定人人血清樣樣品中的的AFPP將含抗人AAFP單單克隆抗抗體（110 g/mml）的的pH值值為9.6的00.1 moll/L碳碳酸鈉緩緩沖溶液液50 l分注注于966微孔板板的各孔孔中，44 0C, 24小小時包被被后將AAFP標標準溶液液或血清清樣品445 l注入入上述包包被后的的微孔板板中，337 00C，11小時反反應(yīng)后

10、，用用緩沖溶溶液1洗洗兩次，緩緩沖溶液液2洗一一次。加加入455 l納米米熒光微微粒標記記的抗AAFP多多抗溶液液，377 0C，11小時反反應(yīng)后，用用緩沖溶溶液1洗洗4次，然然后進行行固相時時間分辨辨熒光測測定。5. 共價價鍵合型型熒光納納米微粒粒的制備備將10.44mg氨氨丙基三三乙氧基基硅 (APSS，477 moll)，77.1moll4,44-biis(11, 1,1,2,2,3,3-hepptaffluooro-4,6-hexxaneedioon-66-yyl)-chlloroosullfo-o- tterpphennyl (BHHHCTT)及33.555mollEuCCl36H2

11、O 加加入300 l環(huán)己己烷中，超超聲振蕩蕩反應(yīng)115分鐘鐘后，反反應(yīng)液加加入到含含有1.1 mml水，44.744 g Triitonn X-1000、3.64 g正辛辛醇及114.550 gg環(huán)己烷烷的W/O型微微乳液中中，攪拌拌0.55小時后后，加入入2000 l的TTEOSS和2000 l的濃濃氨水。室室溫攪拌拌反應(yīng)224小時時后，加加入400 mll丙酮結(jié)結(jié)束反應(yīng)應(yīng)。將反反應(yīng)液離離心后除除去上清清液，沉沉淀部分分用乙醇醇和二次次蒸餾水水分別洗洗三次后后懸浮于于水中備備用。6. 共價價鍵合型型納米微微粒用于于人血清清中乙肝肝表面抗抗原（HHBsAAg）測測定使用抗HBBsAgg單抗和和

12、多抗進進行測定定，測定定步驟與與摻雜型型納米熒熒光微粒粒測定人人血清中中PSAA相同。結(jié)果和討論論 1. 摻雜雜型納米米熒光微微粒的制制備及時時間分辨辨熒光免免疫測定定PSAA摻雜型納米米熒光微微粒的制制備原理理見圖11。在表表面活性性劑和助助表面活活性劑的的作用下下，含有 TEOOS,BBPTAA-Tbb3+的水水溶液在在油相中中形成均均勻的小小液室，每一個個小液室室相當于于一個微微反應(yīng)器器，TEOOS的水水合化和和聚合化化的過程程都被限限制在微微反應(yīng)器器內(nèi)。微反應(yīng)應(yīng)器的體體積主要要由水和和表面活活性劑的的比值所所決定，而微反反應(yīng)器的的體積大大小又決決定了納納米顆粒粒的尺寸寸大小。我們用用這

13、種方方法制備備了直徑徑在422 33 nmm的納米米顆粒(圖2)，由電鏡鏡照片可可以看出出納米顆顆粒形狀狀規(guī)則、尺尺寸均勻勻。圖1 在微微乳液中中制備納納米微粒粒的原理理 圖22 硅膠膠包裹BBPTAA-Tbb3+納米米微粒的的電鏡照照片納米熒光微微粒表面面的硅膠膠經(jīng)過修修飾后可可與生物物分子相相連。將將納米熒熒光微粒粒與SAA共價結(jié)結(jié)合后，可可用于時時間分辨辨熒光免免疫測定定。PSSA是前前列腺癌癌診斷的的一個重重要指標標，現(xiàn)用用于臨床床檢測的的方法主主要有放放射性免免疫法和和酶聯(lián)免免疫法，它它們的檢檢測靈敏敏度大約約在1000pgg/ml左右。而而最近的的研究表表明，如如果方法法的檢測測靈

14、敏度度可達到到20 pg/ml以下，那那么至少少可以提提前一年年診斷出出治療后后前列腺腺癌患者者是否復(fù)復(fù)發(fā)。所所以發(fā)展展高靈敏敏度的血血中PSSA的檢檢測方法法顯得十十分重要要。使用用BPTTA-TTb3+納米微微粒標記記SA的的時間分分辨熒光光免疫分分析法測測定PSSA的工工作曲線線如圖33所示，方方法的最最低檢測測限為77 pgg/mll（用本本底信號號標準偏偏差的33倍計算算）。使使用本方方法對224個人人血清樣樣品的PPSA濃濃度進行行了測定定，并與與臨床測測定的結(jié)結(jié)果進行行了比較較，兩者者的相關(guān)關(guān)性見圖圖4。兩兩種方法法對244個人血血清樣品品中PSSA濃度度測定結(jié)結(jié)果的相相關(guān)性方方

15、程式為為y11.011x00.0008，相相關(guān)系數(shù)數(shù)為0.9988，說明明使用納納米微粒粒作為標標記物的的測定方方法的結(jié)結(jié)果是完完全可信信的。圖3用硅膠膠包裹BBPTAA-Tbb3+納米微微粒標記記SA 圖44 新方方法和臨臨床檢測測法用于于24個個人血清清的時間分辨辨熒光免免疫測定定PSAA的工作作曲線 樣品中中PSAA濃度測定定的相關(guān)關(guān)性2. 共聚聚合型納納米熒光光微粒的的制備及及時間分分辨熒光光免疫測測定AFFPAEPS和和TEOOS一樣樣，都可可以在氨氨水存在在的條件件下發(fā)生生水解和和聚合反反應(yīng)。而而且它具具有的活活性基團團-NHH2在聚合合后會存存在于納納米微粒粒的表面面，為后后續(xù)標

16、記記生物分分子提供供極大的的方便。所所以，在在我們的的研究中中利用將將AEPPS和TTEOSS共聚合合的方法法在微乳乳液中制制備出了了表面帶帶有活性性氨基的的功能性性硅膠包包裹鋱配配合物納納米熒光光微粒。其其電鏡測測定結(jié)果果（見圖圖5）顯顯示這種種納米微微粒不僅僅形狀規(guī)規(guī)則，而而且粒徑徑分布范范圍窄(453nm)。聚合后后存在于于納米微微粒表面面的-NNH2基團使使得生物物標記更更加容易易。通過過簡單的的方法將將納米微微粒與抗抗AFPP抗體結(jié)結(jié)合后，建建立了一一種以納納米微粒粒為標記記物的時時間分辨辨熒光免免疫分析析方法用用于人血血清中AAFP的的測定，其其工作曲曲線見圖圖6。本本方法的的最低

17、檢檢測限為為0.11 ngg/mll，相對對標準偏偏差（CCV%）小于于9.00%，血清清添加回回收率在在84.0-98.0%范圍，說說明該法法具有較較高的精精密度和和準確度度，可以以用于人人血清樣樣品的測測定。圖5功能性性鋱納米米熒光微微粒的電電鏡照片片 圖圖6 測定AAFP的的工作曲曲線3. 共價價鍵合型型納米熒熒光微粒粒的制備備及時間間分辨熒熒光免疫疫測定HHBsAAgBHHCTT-Euu3+是一一種強熒熒光性銪銪配合物物，只是是它的水水溶性較較差，所所以在用用摻雜型型方法制制備納米米微粒時時只有少少量的配配合物被被包進納納米微粒粒中，導(dǎo)導(dǎo)致制得得的納米米微粒熒熒光很弱弱。而采采用共價價

18、鍵合的的方法則則不但可可以增加加每個納納米微粒粒中所包包含BHHHCTT-Eu3+分子的的個數(shù)，從而使得納米微粒的熒光強度得到大幅度提高，而且一次性地在納米微粒表面導(dǎo)入了自由氨基。電鏡測定結(jié)果（見圖7）顯示該法制得的納米微粒大小均勻，粒徑為373nm。圖7 共價價鍵合型型納米微微粒的電電鏡照片片 圖88. 納納米微粒粒標記SSA（aa）和BBHHCCT-EEu3+標記SSA-BBSA（bb）測定定人血清清中HBBsAgg的工作作曲線將納米微粒粒與SAA結(jié)合后后，用于于時間分分辨熒光光免疫測測定人血血清中的的HBssAg，其其工作曲曲線見圖圖8a。本本法的最最低檢測測限為223pg/ml，證證明

19、其靈靈敏度要要高于直直接使用用BHHHCT-Eu3+為標記記物的測測定方法法（圖88b，最最低檢測測限為884pgg/mll）。該該法用于于人血清清樣品測測定的相相對標準準偏差小小于100%，添加回回收率在在80-1100%范圍，說說明該法法具有較較高的精精密度和和準確度度。結(jié)論本研究利用用微乳液液法制備備了三種種硅膠基基質(zhì)納米米稀土熒熒光微粒粒，制備備方法簡簡單且重重復(fù)性好好。所制備備的納米米微粒形形狀規(guī)則則、尺寸寸均勻，在在對其進進行表面面修飾后后用于生生物標記記及時間間分辨熒熒光免疫疫測定，建建立了人人血清中中PSAA、AFPP及HBsAAg的高高靈敏度度定量測測定方法法。由于于新型稀稀

20、土熒光光微粒具具有強熒熒光、強強抗光漂漂白性能能及易用用于生物物標記等等優(yōu)點，預(yù)預(yù)計其在在熒光顯顯微鏡生生物成像像測定及及生物芯芯片等領(lǐng)領(lǐng)域也有有重要的的應(yīng)用前前景，這這部分的的研究工工作將在在近期展展開。注：本文系系由中國國科學院院領(lǐng)域前前沿項目目大連連化物所所青年基基金資助助參考文獻：Soinii, EE.; Lvvgreen, T.CCRC Criit. Revv. AAnall. CChemm. 19987, 188, 1105-1544.Tayloor, J. R.;Fanng, M. M.;Niee, SS. AAnall. CChemm. 20000. 72. 19779-119

21、866.Schrooedtter, A.;Weelleer, H. Anggew. Chhem. Innt. Ed.20002, 17, 32118-332211.Santrra, S.;Zhaang, P.;Waang, K.;Taapecc, RR.;TTan, W. Annal. Chhem. 20001, 733, 449888-49993.Ye, ZZ., Tann, MM., Wanng, G. andd Yuuan, J.Anaalytticaal CChemmisttry.20004，76, 5133-5118.Ye, ZZ., Tann, MM., Wanng, G. and

22、d Yuuan, J.Tallantta.220044In preess. Hai, X., Taan, M., Waang, G., YYe, Z., Yuuan, J. annd MMatssumooto, K.Anaalytticaal SScieencees 220044，20, 2445-2246.Fluorresccentt Laanthhaniide Nanno-mmateeriaals andd Tiime-Ressolvved FluuorooimmmunooasssayZhiqiiangg Yee annd MMinggqiaan TTanDirecctedd byy Jiinglli YYuann annd GGuillan Wanng101 ggrouup, Depparttmennt oof AAnallytiicall ChhemiistrryAbstrractt: TThreee kkindds oof ssiliica-bassed fluuoreesceent lannthaanidde nnanooparrticc