分子病理檢測在神經(jīng)腫瘤治療中的應(yīng)用課件

1、分子病理檢測在神經(jīng)腫瘤治療中的應(yīng)用 一、什么是分子病理二、分子病理檢測與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤治療三、分子病理檢測常用技術(shù)四、介紹兩種分子病理檢測在腦膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用1、 O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)基因啟動子甲基化的檢測2、染色體1p /19q 雜合性缺失的檢測一、什么是分子病理 分子病理是近些年在傳統(tǒng)組織病理學(xué)的基礎(chǔ)上結(jié)合了分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的研究成果, 并采用相關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)逐漸發(fā)展完善起來的交叉學(xué)科。一、什么是分子病理 研究內(nèi)容：病理學(xué)包括運(yùn)用分子和遺傳學(xué)方法對腫瘤進(jìn)行診斷和分類；設(shè)計和驗(yàn)

2、證對治療反應(yīng)和病情發(fā)展的預(yù)測性生物標(biāo)記物，不同的基因構(gòu)成造成的對腫瘤的個人易感性，依此了解腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲性及對抗化療和放療的可能性等信息，為臨床醫(yī)生提供有價值的資料，從而做到有針對性的個體化綜合治療；還有測試環(huán)境因素和生活方式對腫瘤發(fā)生的影響。 二、分子病理檢測與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤治療 腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多因素參與的、多步驟的過程。關(guān)鍵調(diào)控基因的突變導(dǎo)致了基因表達(dá)的失衡從而引起相關(guān)蛋白水平改變，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 在致癌基因主導(dǎo)的情況下，細(xì)胞惡性增殖，阻止了正常細(xì)胞的分化和凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 而抑癌基因編碼的蛋白對細(xì)胞的負(fù)性調(diào)控作用則大大降低，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。二、分子病理檢測與神經(jīng)

3、系統(tǒng)腫瘤治療 表皮生長因子受體(EGFR) 目前研究最多的靶點(diǎn)，許多神經(jīng)腫瘤出現(xiàn)EGFR基因擴(kuò)增，在1/3 的腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中EGFR表達(dá)增加。研究表明表皮生長因子和EGFR與癌細(xì)胞的增殖、分化、侵襲性生長密切相關(guān)。 對于那些EGFR基因擴(kuò)增的患者可以均可給與針對EGFR的分子靶向治療的藥物來影響影響癌細(xì)胞的信號傳遞系統(tǒng)，從而抑制癌細(xì)胞的增殖、分化、侵襲性生長?？擅黠@提高患者的生存質(zhì)量并改善患者的癥狀。二、分子病理檢測與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤治療 p53突變 星形細(xì)胞瘤彌漫浸潤性生長，手術(shù)很難做到全部切除，術(shù)后容易復(fù)發(fā)，腫瘤的惡性程度可能升級。分子病理研究表明，這類患者的預(yù)后并不完全相同。 關(guān)鍵基因是位

4、于17染色體短臂p53發(fā)生突變。 年輕的膠質(zhì)瘤患者，p53發(fā)生突變，對放療與化療相對敏感，相對存活期長；而伴隨EGFR過度表達(dá)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的老年患者，對放療與化療反應(yīng)差存活期短。 二、分子病理檢測與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤治療 ki-67 是一種細(xì)胞增殖核抗原，目前較為肯定的核增殖標(biāo)志。分子病理檢測，ki-67表達(dá)陽性，說明膠質(zhì)瘤處于S期（DNA復(fù)制期）細(xì)胞較多，這類患者不宜于直接術(shù)后放療，而應(yīng)先選擇對S期細(xì)胞敏感的化療藥物，殺滅S期細(xì)胞后，再進(jìn)行放療。 二、分子病理檢測與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤治療 血管內(nèi)皮生長因子受體 腫瘤的生長依賴腫瘤血管供應(yīng)營養(yǎng)。阻斷血管生成是遏止腫瘤生長的有效策略。隨著人們對腫瘤血管形成

5、機(jī)制的了解，針對腫瘤血管形成的分子機(jī)制所設(shè)計的抗血管生成治療策略，已成為目前腫瘤治療的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，許多抑血管生成劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。 PTK/ZK是口服的VEGFR（vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）酪氨酸激酶抑制劑，有抗腫瘤活性。 二、分子病理檢測與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤治療 從以上與神經(jīng)腫瘤治療相關(guān)的基因和分子來看，找到影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物相關(guān)基因和相關(guān)分子，針對這些特異的基因和分子特點(diǎn)采取個體化治療對治療神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤有很大優(yōu)勢。小結(jié)：三、分子病理檢測常用技術(shù) 基因缺失和擴(kuò)增的檢測：基因缺失主要表現(xiàn)是

6、DNA序列的丟失，基因擴(kuò)增主要表現(xiàn)為基因拷貝數(shù)的增加。應(yīng)用普遍的為組織細(xì)胞原位核酸分子雜交，包括原位雜交、熒光原位雜交、對比基因組雜交。近年熒光原位雜交在腫瘤分子診斷中有重要的應(yīng)用。三、分子病理檢測常用技術(shù) 基因突變檢測：1985年以前，主要應(yīng)用Southern雜交，可篩選出基因的缺失、插入和移碼重組等突變形式，對于不能用該法檢測的突變，也可用序列測定分析，但復(fù)雜費(fèi)時。 目前大部分基因突變檢測技術(shù)都是以PCR為基礎(chǔ)，已達(dá)20余種，比較成熟的技術(shù)包括PCR-SSCP法、雜合雙鏈分析法、變性梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳法、化學(xué)切割錯配法、DNA芯片技術(shù)、比較基因組雜交法和DNA序列分析等。四、介

7、紹兩種分子病理檢測在腦膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用 成人中最常見的腦腫瘤是惡性膠質(zhì)瘤，即使在積極地外科手術(shù)和放射治療后，死亡率平均一年。但臨床上也發(fā)現(xiàn)同一種惡性膠質(zhì)腫瘤有著兩種或者多種截然不同化療敏感度和預(yù)后。為找到原因許多學(xué)者進(jìn)行大量研究。目前明確，患者兩種腫瘤基因的改變是造成惡性腦膠質(zhì)瘤臨床治療預(yù)后差異的主要原因： MGMT啟動子甲基化 染色體1p/19q雜合性缺失四、介紹兩種分子病理檢測在腦膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用甲基化特異性PCR法檢測O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)基因啟動子甲基化的檢測。熒光原位雜交技術(shù)（

8、fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測染色體1p /19q 雜合性缺失。MGMT啟動子甲基化 MGMT是一種從細(xì)菌到哺乳類動物機(jī)體中都存在的獨(dú)特的DNA修復(fù)蛋白，MGMT能夠修復(fù)被化療藥物烷基化的鳥嘌呤，增加了腫瘤細(xì)胞對這些藥物的耐藥性。 許多研究資料已經(jīng)證實(shí)，MGMT在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)增多明顯減弱亞硝基脲類抗腫瘤藥物的治療效果。MGMT啟動子甲基化 Hegi等研究表明：對腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT基因啟動子甲基化的患者采用放療聯(lián)合替莫唑胺化療，其生存期明顯變長。 MGMT基因啟動子甲基化狀態(tài)與腫瘤細(xì)胞對烷化劑藥物敏感性密切相關(guān)，腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT

9、基因啟動子甲基化的患者臨床預(yù)后較好。MGMT啟動子甲基化檢測基因甲基化的經(jīng)典方法：甲基化特異性PCR（Methylmion Specific PCR，MSP）MSP法的原理是首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶都被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則不變。然后設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，最后通過瓊脂糖凝膠電泳分析，如果處理后甲基化DNA 鏈的引物能擴(kuò)增出片段，則說明該被檢測的位點(diǎn)存在甲基化。PCR儀凝膠電泳電泳半定量圖像分析MGMT啟動子甲基化 1、只能進(jìn)行終點(diǎn)檢測。 2、擴(kuò)增產(chǎn)物需要跑膠和手工收集數(shù)據(jù)和后期處理。 3、實(shí)驗(yàn)在一個開

10、放的系統(tǒng)完成，可變因素和人為因素增加。 4、靈敏度很低。 這種方法只能粗略定量甲基化的程度，對于臨床診斷的意義比較低，檢側(cè)重現(xiàn)性差，目前很少用于臨床檢測。問題MGMT啟動子甲基化 目前推薦的方法是高分辨率熔點(diǎn)曲線分析法（HRM, High-Resolution Melting Analysis）：自Wojdacz TK 等人2006年多次報道用來診斷MGMT甲基化以來，HRM是公認(rèn)的快速、準(zhǔn)確、相對低成本檢測DNA甲基化的方法，已成為目前推薦使用的診斷DNA甲基化的方法。 它是一種閉管方法，不需要跑膠和手工收集數(shù)據(jù)，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物無需離開反應(yīng)管即可直接進(jìn)行檢測, 減少了外界污染的機(jī)會，增加了

11、結(jié)果的可靠性。HRM法原理對于甲基化較多的PCR產(chǎn)物，GC含量高，Tm值較高甲基化的胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）甲基化的胞嘧啶（C）未甲基化的胞嘧啶（C）基因組DNA亞硫酸氫鈉修飾處理GC含量變化熔解曲線 Tm 值變化DNA樣本提取制備(石蠟切片、組織、外周血) 甲基化陽性對照/非甲基化陰性對照（100、50、25、6.2、1.5、0.4、0%）DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化Me-C Me-CC U注意:控制DNA量（DNA量過多假陽性； DNA量過少假陰性）甲基化特異性HRM操作步驟:對于甲基化較多的PCR產(chǎn)物，GC含量高，Tm值較高實(shí)時熒光PCR儀利用HRM軟件MGMT啟動子甲基化HRM方法需一臺實(shí)時

12、熒光PCR儀1、試劑相對便宜，相比于傳統(tǒng)的方法，它的成本低廉，分辨率高，通量靈活（最多一次篩查384個樣本，最少幾個樣本）;2、并且準(zhǔn)確率大大提升?？梢詸z測出樣本DNA 中微量甲基化的部分( 甲基化DNA 僅占0.1% 1% ) ; 3、另外該方法檢測所需時間短, 現(xiàn)在在2 到3 小時之內(nèi)拿到數(shù)據(jù)已經(jīng)成為可能;小結(jié)：檢測染色體1p /19q缺失少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤(Oligodendroglioma，OG) 顯示特異性的基因改變，可以與其他類型膠質(zhì)瘤區(qū)別，對于診斷、治療以及判斷預(yù)后都有很重要的意義，是腦腫瘤中第一個應(yīng)用分子病理診斷指導(dǎo)治療的腫瘤。最常見的基因改變是19號染色體長臂（19q)的雜合子缺

13、失，發(fā)生率為5080，其次是1號染色體短臂(1p)的雜合子缺失，發(fā)生率為4092。檢測染色體1p /19q缺失1998年，Caimcross等報道了1p/l9q雜合性缺失具有較長的生存期。44例間變性少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤，存在染色體1p/19q雜合性缺失的皆對PCV （甲基芐肼、環(huán)亞硝脲、長春新堿）方案敏感。50患者平均生存期為10年，而無1p/19q LOH者平均生存期僅為2年。檢測染色體1p /19q缺失隨后許多學(xué)者的研究都為利用少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤分子遺傳學(xué)特征來評價放化療的療效提供了有價值的信息。 1p/19q雜合性缺失預(yù)后較好，對PCV化療 敏感。1p單獨(dú)缺失少見常預(yù)示需要放療與化療相結(jié)合。認(rèn)為

14、19q缺失可以認(rèn)為預(yù)示腫瘤向好的方向發(fā)展。運(yùn)用熒光原位雜交（FISH）檢測技術(shù)檢測腫瘤1p和/或19q等位基因的單獨(dú)或聯(lián)合缺失對少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤的診斷、治療和預(yù)后的判斷有積極意義。檢測染色體1p /19q缺失FISH ：熒光原位雜交（Florescence In-situ Hybridization FISH）是用熒光素標(biāo)記而進(jìn)行檢測的特異性原位雜交，在熒光顯微鏡下對熒光信號進(jìn)行辨別和計算，最終通過熒光信號的顏色和數(shù)目的異常與否，達(dá)到疾病診斷的目的。可在石蠟白片上進(jìn)行而且分辨率較高。檢測染色體1p /19q缺失注：檢測方法1分別使用兩組探針：1) 1p36/1q21：1p36標(biāo)記為紅色，1q21標(biāo)記為綠色；2) 19q13/19p13：19q13標(biāo)記為紅色，19p13標(biāo)記為綠色。2經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)計數(shù)細(xì)胞數(shù)量（200個左右），統(tǒng)計紅綠熒光信號比值（Ratio）。圖1 1p36/1q21圖2 19q13/19p13 分子診斷技術(shù)是腫瘤分子病理研究具有劃時代意義的檢測手段，目前，神經(jīng)分子病理