（報(bào)批稿）《梨火疫病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)技術(shù)技術(shù)規(guī)程》

1、ICS FORMTEXT 65.020.01CCS FORMTEXT B 16DB FORMTEXT 32DB FORMTEXT 32/T XXXX FORMTEXT 2022 FORMTEXT 梨火疫病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)技術(shù)規(guī)程Code of practice for monitoring and detection of pear fire blight FORMTEXT 報(bào)批稿 FORMTEXT FORMTEXT 2022 - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX發(fā)布2022 - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX實(shí)施 FORMTEXT 江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)布D

2、B32/T XXXX2022 前言本文件按照 GB/T 1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件由江蘇省園藝標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、江蘇省植物保護(hù)植物檢疫站。本文件主要起草人：劉鳳權(quán)、趙延存、徐高歌、李朝輝、龔偉榮、孫偉波、趙楊揚(yáng)、明亮、周麗川、胡婕。梨火疫病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)技術(shù)規(guī)程1 范圍本文件規(guī)定了梨火疫病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)的原理、監(jiān)測(cè)植物、設(shè)備與試劑、病害監(jiān)測(cè)、病菌檢測(cè)、結(jié)果判定和報(bào)告、樣品和菌株保存及無(wú)害化處理等。本文件適用于梨火疫病監(jiān)測(cè)與病菌檢測(cè)。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不

3、可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 15569 農(nóng)業(yè)植物調(diào)運(yùn)檢疫規(guī)程GB/T 36852 亞洲梨火疫病菌檢疫鑒定方法DB32/T 3788 梨枯梢病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)技術(shù)規(guī)程3 術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4 原理梨火疫病，病原為解淀粉歐文氏菌（Erwinia amylovora (Burrill, 1883) Winslow et al., 1920），是危害梨、蘋(píng)果、杜梨、山楂、海棠、榅桲等薔薇科植物的檢疫性有害生物。根據(jù)梨火疫病田間癥狀、病菌生物學(xué)特征、致病特性、免疫學(xué)和分子生物學(xué)

4、反應(yīng)特征等進(jìn)行監(jiān)測(cè)和檢測(cè)。5 監(jiān)測(cè)植物梨和蘋(píng)果。6 設(shè)備與試劑6.1 用具與儀器采集夾、采集袋、標(biāo)本夾、標(biāo)本紙、修枝剪、紙袋、放大鏡、鑷子、刀片、標(biāo)簽紙、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、體視顯微鏡、低溫高速離心機(jī)、電泳儀、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、微量移液器、定位器等。6.2 試劑與材料監(jiān)測(cè)與檢測(cè)過(guò)程中所有試劑、溶液及培養(yǎng)基配方，參見(jiàn)附錄A。除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純或生化試劑。7 病害監(jiān)測(cè)7.1 監(jiān)測(cè)范圍監(jiān)測(cè)梨、蘋(píng)果集中種植區(qū)。對(duì)疫情發(fā)生區(qū)或高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)的果園、苗圃和采穗圃，以及從發(fā)生區(qū)或高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)調(diào)入的苗木、砧木、接穗和花粉等進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測(cè)。7.2 田間監(jiān)測(cè)7.2.1 監(jiān)測(cè)時(shí)期每年

5、4月7月，重點(diǎn)在梨樹(shù)、蘋(píng)果樹(shù)開(kāi)花期到果實(shí)膨大中期進(jìn)行監(jiān)測(cè)調(diào)查，尤其是在雨后或澆水后。7.2.2 訪問(wèn)調(diào)查向當(dāng)?shù)刂脖T、農(nóng)技員、果農(nóng)、種苗和農(nóng)藥經(jīng)銷(xiāo)商等相關(guān)人員詢(xún)問(wèn)梨樹(shù)和蘋(píng)果樹(shù)果園、苗圃和采穗圃是否有梨火疫病疑似癥狀（見(jiàn)附錄B）及其發(fā)生地點(diǎn)、時(shí)間、危害情況等信息，判斷是否存在可疑發(fā)生區(qū)。每年在花期和幼果期各調(diào)查1次。7.2.3 踏查對(duì)訪問(wèn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)的可疑發(fā)生區(qū)和其他有代表性的果園、苗圃和采穗圃進(jìn)行踏查，觀察田間是否有梨火疫病典型癥狀（見(jiàn)附錄B）。如發(fā)現(xiàn)典型或可疑癥狀的病株，立刻進(jìn)行標(biāo)記和拍照，取樣后送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定。每年在花期和幼果期各踏查1次。7.2.4 定點(diǎn)監(jiān)測(cè)在踏查確認(rèn)的發(fā)生區(qū)或高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)，選

6、擇有代表性的果園、苗圃和采穗圃進(jìn)行定點(diǎn)調(diào)查，每15 d調(diào)查1次。面積小于50畝的設(shè)置1個(gè)調(diào)查樣地，面積每增加50畝增設(shè)1個(gè)調(diào)查樣地，樣地面積不小于5畝。在樣地內(nèi)采用5點(diǎn)取樣法，每個(gè)點(diǎn)隨機(jī)調(diào)查不少于20株，調(diào)查并統(tǒng)計(jì)病株率。按照附錄C要求記錄相關(guān)信息，并將病樣送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定。7.3 調(diào)運(yùn)監(jiān)測(cè)7.3.1 苗木、砧木、接穗監(jiān)測(cè)對(duì)來(lái)自疫情發(fā)生區(qū)或高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的種苗、砧木、接穗按 GB 15569 要求進(jìn)行抽樣檢查，對(duì)病樣或疑似病樣送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)鑒定；對(duì)無(wú)癥狀樣品，至少隨機(jī)選取5份送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定。7.3.2 花粉監(jiān)測(cè)按GB 15569 要求進(jìn)行抽樣，并送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定。8 病菌檢測(cè)8.1 樣品處理8

7、.1.1 病樣和疑似病樣處理按照 GB/T 36852 要求執(zhí)行。8.1.2 無(wú)癥狀樣品處理先用75%乙醇對(duì)樣品表面進(jìn)行消毒，晾干，然后從每個(gè)無(wú)癥種苗、接穗、砧木隨機(jī)切取新生樹(shù)皮（包含維管束部分）2 塊3 塊，每塊約 20 mm2，加入到裝有 2 mL3 mL 無(wú)菌水的無(wú)菌離心管中浸泡30 min，制備樣品浸出液。每份花粉樣品取 0.1 g，加入到裝有 1 mL2 mL無(wú)菌水的無(wú)菌離心管中浸泡30 min，制備樣品浸出液。8.2 顯微鏡檢查按照 DB32/T 3788 要求執(zhí)行。8.3 生物學(xué)特征觀察將樣品浸出液在NA培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)或梯度稀釋分離，28培養(yǎng)24 h48 h。挑取單菌落在NA培

8、養(yǎng)基上進(jìn)一步劃線(xiàn)純化2次3次，獲得觀察記錄菌落形態(tài)和其它特征，也可用透射電鏡觀察菌體形態(tài)、大小、有無(wú)鞭毛及鞭毛著生的位置和數(shù)目等（參見(jiàn)附錄B）。8.4 致病性測(cè)定將純化的分離物接種幼果，24 h 48 h后觀察接種部位有無(wú)壞死和菌膿產(chǎn)生；或接種嫩稍48 h 96 h后，觀察接種點(diǎn)是否出現(xiàn)變黑、組織干癟、枝梢萎蔫、菌膿溢出等癥狀。8.5 ELISA檢測(cè)取樣品浸出液或用純化的分離物配制成的菌懸液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，檢測(cè)程序參見(jiàn)附錄D。如采用商品化ELISA試劑盒檢測(cè)，按照說(shuō)明書(shū)操作并進(jìn)行結(jié)果判定。8.6 PCR檢測(cè)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件，可選擇PCR凝膠電泳檢測(cè)或?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)，檢測(cè)程序按照附錄E。9

9、 結(jié)果判定和報(bào)告 結(jié)果判定9.1.1 田間癥狀初判田間梨樹(shù)和蘋(píng)果樹(shù)發(fā)病癥狀符合附錄B描述的典型癥狀，初步判斷為梨火疫病并送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定。常規(guī)檢測(cè)結(jié)果判定鏡檢有溢菌現(xiàn)象；分離物生物學(xué)特征與梨火疫病菌相符（參見(jiàn)附錄B）；分離物在幼果或嫩梢上的致病性測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性，且能再次從接種發(fā)病部位分離獲得相同的分離物，判定分離物為引起梨火疫病的病原菌即梨火疫病菌。ELISA檢測(cè)結(jié)果判定在陰性對(duì)照OD值小于等于0.1，且陽(yáng)性對(duì)照OD值大于等于陰性對(duì)照OD值2倍的前提下，檢測(cè)樣品OD值大于等于陰性對(duì)照OD值2倍時(shí)，判定為陽(yáng)性反應(yīng)，即從樣品中檢出梨火疫病菌；否則判定為陰性反應(yīng)，即從樣品中未檢出梨火疫病菌。PCR

10、檢測(cè)結(jié)果判定PCR 檢測(cè)結(jié)果按照附錄E判定。9.2 結(jié)果報(bào)告9.2.1 監(jiān)測(cè)報(bào)告按照附錄C填寫(xiě)監(jiān)測(cè)結(jié)果，整理匯總后形成監(jiān)測(cè)報(bào)告。9.2.2 檢測(cè)報(bào)告按照附錄F填寫(xiě)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定結(jié)果，形成檢測(cè)鑒定報(bào)告。10 樣品和菌株保存及無(wú)害化處理10.1 樣品保存4 下保存，以備復(fù)核。保存樣品要標(biāo)明編號(hào)、名稱(chēng)、來(lái)源、保存人、保存日期和到期日期。樣品保存期滿(mǎn)后，應(yīng)滅活銷(xiāo)毀處理。10.2 菌株保存分離并鑒定為梨火疫病菌的菌株可采用甘油低溫保存或凍干保存。10.3 無(wú)害化處理監(jiān)測(cè)和檢測(cè)過(guò)程中使用過(guò)的有關(guān)材料、用具、不需要長(zhǎng)期保存的菌液、分離菌株等，在使用完畢和試驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)及時(shí)進(jìn)行滅活銷(xiāo)毀處理。 附 錄 A（資料性

11、附錄）試劑及培養(yǎng)基配制方法A.1 ELISA檢測(cè)包被液Na2HCO3 2.93 g、NaCl 1.59 g，用蒸餾水溶解，調(diào)整pH值到9.6，定容至1000 mL。洗滌液Na2HPO412H2O 3.58 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0.27 g、NaCl 8.01 g、吐溫-20 0.5 g，用蒸餾水溶解，調(diào)整pH值到7.4，定容至1000 mL。樣品提取液Na2HPO412H2O 3.58 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0.27 g、NaCl 8.01 g，用蒸餾水溶解，調(diào)整pH值到7.4，定容至1000 mL。封閉液脫脂奶粉5 g，溶解于100 mL樣品提取液?？贵w稀釋

12、液脫脂奶粉2.5 g，溶解于100 mL洗滌液。TMB顯色液底物緩沖液Na2HPO412H2O 2.375 g、檸檬酸 1.1675 g，用蒸餾水溶解，調(diào)整pH值到5.0，定容至250 mL。TMB母液10 mg TMB溶于1 mL二甲亞砜（DMSO）中，4保存。0.75%H2O2取25 L 30% H2O2用超純水定容到1 mL，4避光保存。顯色液在10 mL底物緩沖液加入100 L TMB母液和32 L 0.75% H2O2混勻后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。終止液濃硫酸 11.1 mL，用蒸餾水定容到100 mL。A.2 PCR檢測(cè)A.2.1 電泳緩沖液TBE在1 000 mL去離子水中加入Tris堿

13、 54 g、硼酸27.5 g、20 mL 0.5 M EDTA（pH 8.0），使用時(shí)利用去離子水10倍稀釋?zhuān)礊?.5TBE。A.2.2 瓊脂糖凝膠在0.5TBE工作液中加入1% (w/v)的瓊脂糖，融化，冷卻至60后添加0.01%（v/v）的核酸染料并混勻，然后倒入插入梳子的制膠槽中，冷卻凝固后點(diǎn)樣電泳。A.3 實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液商品化的實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液，按照商品說(shuō)明書(shū)使用。A.4 NA培養(yǎng)基取蛋白胨 5 g，蔗糖 10 g，酵母提取物 1 g，牛肉浸膏 3 g，瓊脂 16 g，加水定容至 1 000 mL，調(diào)pH至 6.87.2，121 濕熱滅菌 20 min。附 錄 B（資料性附

14、錄）梨火疫病基本信息B.1 分類(lèi)地位細(xì)菌界（Eubacteria），變形菌門(mén)（Proteobacteria），-變形菌綱（Gammaproteobacteria），腸桿菌目（Enterobacterales），腸桿菌科（Enterobacteriaceae），歐文氏菌屬（Erwinia），解淀粉歐文氏菌（E. amylovora (Burrill) Winslow et al.）。B.2 生物學(xué)特征革蘭氏陰性細(xì)菌，菌體短桿狀，有莢膜，周生鞭毛，大小為（0.6 m 0.8 m）（1.0 m 3.0 m），多數(shù)單生。最適生長(zhǎng)溫度25 2 8 ，最適pH 6.06.5。在NA培養(yǎng)基上2 8 培養(yǎng)2

15、d后，菌落直徑達(dá)到1 mm 2 mm，乳白色、圓形、凸起、平滑、不透明、有光澤、邊緣完整。圖B.1 梨火疫病菌（Erwinia amylovora）的菌落及菌體形態(tài)B.3 田間癥狀特征病原菌主要通過(guò)傷口和自然孔口（氣孔、蜜腺、水孔等）侵入寄主組織。受害花、葉、嫩梢和果實(shí)等枯萎變黑，引起花腐、枝枯和僵果，但不脫落，被侵染的嫩枝呈“牧羊鞭狀”。遇潮濕、溫暖天氣，從病部溢出大量乳白色粘稠狀菌膿?；ê陀坠芎ΠY狀嫩稍和葉柄受害癥狀 枝干和樹(shù)皮受害癥狀整株枯死癥狀圖B.2 梨火疫病田間典型病害癥狀附 錄 C（規(guī)范性附錄）梨火疫病田間調(diào)查/監(jiān)測(cè)結(jié)果記錄表調(diào)查機(jī)構(gòu)： 調(diào)查時(shí)間： 調(diào)查人：編號(hào)調(diào)查地點(diǎn)果樹(shù)/材

16、料品種/樹(shù)齡生育期來(lái)源種植面積（畝）調(diào)查面積（畝）發(fā)生面積（畝）調(diào)查株數(shù)（株）發(fā)病株數(shù)（株）病株率（%）檢測(cè)鑒定結(jié)果備注 注：材料指苗木、砧木、接穗和花粉等；備注欄可填寫(xiě)田間癥狀、農(nóng)事操作、抽樣檢測(cè)情況等信息。 調(diào)查人（簽字）：附 錄 D（資料性附錄）梨火疫病菌雙抗夾心ELISA檢測(cè)程序D.1 包被捕獲抗體提前按照市售產(chǎn)品要求用包被液進(jìn)行稀釋?zhuān)缓竺靠准尤?00 L包被于96孔酶標(biāo)板上。4 孵育12 h16 h后棄去孔中液體，用洗滌液加滿(mǎn)每個(gè)反應(yīng)孔，靜置1 min2 min后，將洗滌液緩慢倒出，重新加入新的洗滌液，重復(fù)上述步驟3次。洗板完成后將酶標(biāo)板倒置于干凈的吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中的水分。D

17、.2 封閉酶標(biāo)板中每孔加入200 L封閉液，37 封閉1.5 h后棄去封閉液，用洗滌液洗板3次，每次2 min。洗板完成后將酶標(biāo)板倒置于干凈的吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中的水分。D.3 加樣加入梯度稀釋的樣品浸出液或菌懸液、梨火疫病菌菌懸液（108 CFU/mL，陽(yáng)性對(duì)照）和樣品提取液（陰性對(duì)照），每孔100 L。室溫孵育1 h后棄去孔中液體，用洗滌液洗板4次，每次2 min。洗板完成后將酶標(biāo)板倒置于干凈的吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中的水分。每個(gè)檢測(cè)樣品至少重復(fù)3次。D.4 加酶標(biāo)檢測(cè)抗體-HRP復(fù)合物每孔加入100 L檢測(cè)抗體-HRP復(fù)合物，抗體HRP復(fù)合物提前按照市售產(chǎn)品要求進(jìn)行稀釋?zhuān)糜诒袢萜髦校?/p>

18、25 孵育1 h。用洗滌液洗板4次，每次2 min。洗板完成后將酶標(biāo)板倒置于干凈的吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中的水分。D.5 顯色提前15 min配好顯色液，每孔加入100 L，25避光顯色20 min至陽(yáng)性對(duì)照顯色。D.6 終止反應(yīng)顯色后在每孔加入50 L終止液。D.7 測(cè)定在波長(zhǎng)450 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)量結(jié)果，讀取各孔溶液的光密度值（OD值），記錄結(jié)果。附 錄 E（規(guī)范性附錄）PCR檢測(cè)E.1 PCR凝膠電泳檢測(cè)E.1.1 引物序列引物序列pEA29A5- CGGTTTTTAACGCTGGG -3pEA29B5- GGGCAAATACTCGGATT -3E.1.2 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件25

19、L反應(yīng)體系：2PCR反應(yīng)預(yù)混液12.5 L，上游引物（10 mol/L）1 L，下游引物（10 mol/L）1 L，模板1 L，補(bǔ)充超純水至25 L。PCR反應(yīng)程序：94 5 min； 94 1 min，52 1 min，72 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 10 min；4 保存。注：不同儀器可根據(jù)儀器要求將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。E.1.3 瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為1000 bp。圖D.1 梨火疫病樣PCR檢測(cè)凝膠電泳圖譜E.1.4 結(jié)果判定在陽(yáng)性對(duì)照在預(yù)期位置產(chǎn)生明顯條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照在預(yù)期位置未產(chǎn)生條帶的前提下：如果檢測(cè)樣品出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的條帶，則為陽(yáng)性；如果檢測(cè)樣品沒(méi)有出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的條帶，則為陰性；檢測(cè)結(jié)果至少重復(fù)3次。E.2 實(shí)時(shí)熒光PCR E.2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR引物及探針序列序號(hào)引物或探針序列1Ea-lscF5-CGCTAACAGCAGATCGCA-3Ea-lscR5-AAATA