流式細(xì)胞技術(shù)課件

1、第15章 流式細(xì)胞技術(shù)的原理和應(yīng)用陳鯉翔 副教授Email：流式細(xì)胞技術(shù)（Flow cytometry, FCM) 是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速對(duì)單個(gè)細(xì)胞或其他生物微粒（如細(xì)菌）的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。流式細(xì)胞儀是測(cè)量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析儀，是在單個(gè)細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對(duì)細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進(jìn)行快速測(cè)量并可分類收集的高技術(shù)。30年代：設(shè)想使細(xì)胞檢測(cè)自動(dòng)化50- 60年代：分層鞘流原理、分光光度計(jì)定量細(xì)胞成分及結(jié)合測(cè)量值對(duì)細(xì)胞分類，提出細(xì)胞分選70年代：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)1973年：第一

2、臺(tái)商用流式細(xì)胞儀FACS I發(fā)展方向：熒光染料的開發(fā)、細(xì)胞的制備方法、提高電子信號(hào)的處理能力等流式細(xì)胞儀的發(fā)展史BD公司流式細(xì)胞儀FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSVantageFACSAriaMoFlo Astrios EQ 超高速流式分選系統(tǒng)Gallios流式細(xì)胞儀Beckman公司流式細(xì)胞儀Navios流式細(xì)胞分析系統(tǒng)應(yīng)用：細(xì)胞生物學(xué)，腫瘤學(xué)，血液學(xué)，免疫學(xué)，藥理學(xué)，遺傳學(xué)及臨床檢驗(yàn)學(xué)等細(xì)胞組成細(xì)胞功能大小細(xì)胞表面/胞漿/核-特異性抗原粒度細(xì)胞活性DNA, RNA含量胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子, PH值, 膜電位酶活性流式細(xì)胞儀常檢

3、測(cè)的細(xì)胞特性液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)一、流式細(xì)胞技術(shù)原理1、流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)：Fluorescence SignalFocused Laser BeamShealth Fluid液流系統(tǒng)示意圖Injector Tip樣本管鞘液管激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長(zhǎng)/短波長(zhǎng)，通過短/長(zhǎng)波長(zhǎng)光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通光電倍增管：FS, SS（散射光），F(xiàn)L1, FL2, FL3, FL4（熒光）（2）光學(xué)系統(tǒng)散射光的測(cè)定細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍360立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射

4、等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。光信號(hào)的測(cè)定側(cè)向散射光（side scatter, SS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。 測(cè)得的FS與SS信號(hào)通過計(jì)算機(jī)處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。 此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞光散射測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群 熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開，送入不同的

5、光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。線性放大器和對(duì)數(shù)放大器熒光測(cè)定熒光補(bǔ)償FITCAPCPEPerCP/Cy5.5每一種熒光分子都發(fā)射某一特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光，然而這些熒光的發(fā)射光譜會(huì)發(fā)生重疊，有時(shí)這種重疊現(xiàn)象非常顯著。熒光補(bǔ)償是指修正熒光滲漏的過程，如從探測(cè)器除去除匹配熒光以外的任何熒光信號(hào)。熒光補(bǔ)償PEFITCPE+ cellsFITC + cellsTo do colour compensation:For Pure FITC+ cells, = PE signal - % FITC signalFor Pure PE+ cells,= FITC sign

6、al - % PE signalAfter compensationPEFITCPE+ cellsFITC + cellsGOOD compensation:Y-mean of the FITC cell = the Y-mean of -/- cellsX-mean of the PE cell = the X-mean of -/- cellsPEFITCPE+ cellsFITC + cellsOVER compensation分選速度：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率。分選收獲率：實(shí)際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過測(cè)量點(diǎn)的分

7、選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實(shí)際得率。與分選速度成反比。分選的技術(shù)要求（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少參數(shù)單參數(shù)直方圖雙參數(shù)點(diǎn)圖、二維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析數(shù)據(jù)顯示方式雙參數(shù)點(diǎn)圖雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。 用等高線來表示細(xì)胞數(shù)，在一條

8、等高線上細(xì)胞數(shù)相同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。二維等高圖三參數(shù)直方圖 三維坐標(biāo)勻?yàn)閰?shù)（散射光或熒光）而非細(xì)胞數(shù)。多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。一般利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設(shè)門（Gate)技術(shù)，來分析參數(shù)之間的相互關(guān)系。多參數(shù)分析Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。 門（Gate）設(shè)置A 淋巴細(xì)胞B 單核細(xì)胞C 中性粒細(xì)胞A、B、

9、C均為任意門區(qū)閾（region, R）與門(gate, G ) 是兩個(gè)相關(guān)的概念，區(qū)閾可與門對(duì)應(yīng)，但是也可以包含于門。Region設(shè)置D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字門分析時(shí)，就可以由四個(gè)區(qū)域構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。 樣本制備：?jiǎn)渭?xì)胞懸液標(biāo)記染色：光譜不重疊陰性對(duì)照的設(shè)置：檢測(cè)標(biāo)本的重復(fù)性質(zhì)量控制 二、流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求 外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備：淋巴細(xì)胞分離液分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞。Ficoll，40kd，高密度，低滲透壓，無毒性。（比重為1.01770.001的分層液)樣本制備 利用紅細(xì)胞裂解液

10、去除紅細(xì)胞后，得到外周血中所有白細(xì)胞的流式細(xì)胞分析的二維散色光點(diǎn)圖。培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備：?jiǎn)螌优囵B(yǎng)細(xì)胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來，然后離心漂洗。 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，可不用酶消化，直接吹打制備成單細(xì)胞懸液。新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備機(jī)械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法。酶處理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。化學(xué)試劑處理法：EDTA、EGTA等。表面活性劑處理法：Triton-x100、皂素等。防止細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞膜原有的特性保存的方法：1、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。2、乙醇與甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。3、甲醛或多聚甲醛固定法：細(xì)胞不具有生物活性，但 細(xì)

11、胞表面熒光染色分析不受影響。單細(xì)胞懸液的保存適用條件:有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)對(duì)488nm的激發(fā)光波長(zhǎng)有較強(qiáng)的吸收發(fā)射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)間有較大的波長(zhǎng)差易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性常用的熒光染料與標(biāo)記染色FITCTexas redPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細(xì)胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復(fù)合染料藻膽蛋白類幾種常見的熒光染料名稱染料激發(fā)波長(zhǎng)熒光顏色溶解性對(duì)PH敏感性特點(diǎn)異硫氰酸熒光素FITC488綠 525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅Texas red568紅 615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較

12、多發(fā)光基團(tuán)，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復(fù)合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過一個(gè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而檢測(cè)到該特定熒光信號(hào)。能量傳遞復(fù)合染料Laser488nmPECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復(fù)合染料機(jī)制熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方式結(jié)構(gòu)親和式嵌入結(jié)合共價(jià)鍵結(jié)合熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記方法直標(biāo):干擾少,但需購(gòu)買多種單抗間標(biāo):步驟

13、多,干擾多,不需標(biāo)記多種抗體組合標(biāo)記：免疫熒光標(biāo)記FITC+PE 488 525 、575 綠色、橙色FITC+T red 488 525 綠色 568 615 紅色FITC+PeCy5 488 525、 675 綠色、 紅色FITC+ ECD 488 525、 625 綠色、橙紅色F+P +PeCy5 488 525、575、675 綠、橙、紅色F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 綠、 橙紅色、紅色F+P+APC 488 525 、 575 綠色、橙色 633 670 紅色熒光染料 激發(fā)波長(zhǎng)（nm) 發(fā)射波長(zhǎng)（nm) 顏色雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)記適當(dāng)?shù)闹苽浞绞教幚?/p>

14、紅細(xì)胞實(shí)體組織來源標(biāo)本用機(jī)械法溫度25-37，PH7.0-7.2質(zhì)量控制單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控免疫熒光染色的質(zhì)控溫度PH染料濃度固定劑光路與流路校正: 確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（CV）。PMT（光電倍增管）校準(zhǔn): 保證樣品檢測(cè)時(shí)儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。絕對(duì)計(jì)數(shù)校準(zhǔn): 保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。Flow-checkFlow-setFlow-count儀器操作的質(zhì)控同型對(duì)照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照，選用相同源性的未標(biāo)記單抗作為對(duì)照調(diào)整和設(shè)置電壓，以保證特異性。全程質(zhì)量控制：在流式檢測(cè)中，樣品標(biāo)記、溶血、洗滌、儀器質(zhì)量控制和上機(jī)檢測(cè)的過程都會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果。采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品來進(jìn)行全

15、程質(zhì)控，使得同類實(shí)驗(yàn)室建立質(zhì)控比對(duì)，數(shù)據(jù)可以互用。免疫檢測(cè)的質(zhì)控三、流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用以細(xì)胞免疫功能測(cè)定為例淋巴細(xì)胞亞群活化的T淋巴細(xì)胞抗原特異性免疫細(xì)胞調(diào)控性T細(xì)胞樹突狀細(xì)胞先天免疫細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群T淋巴細(xì)胞(CD3+)名 稱功 能CD3+CD4+輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th/Ti)輔助和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫 CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29-輔助性T細(xì)胞(Th)誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Ti)輔助細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細(xì)胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細(xì)胞 CD3+CD8+CD28- CD3+CD4+CD29-抑制性T細(xì)胞(Ts

16、)殺傷性T細(xì)胞(Tc)抑制細(xì)胞和體液免疫細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD3+CD4+CD8+活化的T細(xì)胞在T細(xì)胞惡性增生時(shí)升高 CD3+CD4-CD8- 有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞,其表達(dá) / T細(xì)胞受體(TCR / ) CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO- 幼稚的/靜止的T淋巴細(xì)胞 當(dāng)免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞時(shí)此細(xì)胞亞群較低 CD45RA-CD45RO+ 記憶性T淋巴細(xì)胞 病菌感染時(shí)升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+ 活化的T細(xì)胞, 感染時(shí)升高 感染時(shí)升高淋巴細(xì)胞亞群活化T淋巴細(xì)胞名 稱功 能CD3+HLA-DR+活化T細(xì)胞

17、CD4+HLA-DR+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞CD4+CD25+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞在病毒感染的患者中增加; 其增加意味著HIV患者的預(yù)后較差B淋巴細(xì)胞(19+)CD19+CD23+ 活化的B細(xì)胞過敏患者中升高 CD19+CD5+ 在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+ 慢性B細(xì)胞白血病及單克隆B淋巴細(xì)胞 NK細(xì)胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病時(shí)降低, 而病毒感染時(shí)升高 CD3+CD57+CMV(巨細(xì)胞病毒)感染的強(qiáng)烈征兆 Th1Th2細(xì)胞因子分泌細(xì)胞測(cè)定根據(jù)產(chǎn)生的細(xì)胞因子的類型和生物學(xué)功能,人的4+細(xì)胞可以分為1、21細(xì)胞產(chǎn)生 2、 12、 、 等細(xì)胞因子,主要參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、遲發(fā)性過敏反應(yīng),并在清除病毒等細(xì)胞內(nèi)致病因子方面起著重要作用2細(xì)胞分泌 4、 5、 6、 10、 13等細(xì)胞因子,主要促進(jìn)體液免疫反應(yīng),中和胞外病原體相應(yīng)地，CD8+T細(xì)胞也可以分為Tc1和Tc2Th1細(xì)胞：介導(dǎo)細(xì)胞免疫、細(xì)胞毒性T細(xì)