MTT比色法測定細胞生長曲線、細胞生長曲線擬合、課件

1、1.MTT比色法測定細胞生長曲線2.細胞生長曲線的擬合及細胞群體倍增時間的簡化計算1.MTT比色法測定細胞生長曲線細胞生長曲線細胞生長曲線是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，是培養(yǎng)細胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。 一般細胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長短不同的遲緩期（潛伏期），即進入大量分裂的對數(shù)生長期。在細胞達到飽和密度后，停止生長，進入穩(wěn)定期，然后退化衰亡。 以存活細胞數(shù)(萬/mL)對培養(yǎng)時間(h或d)作圖，即得生長曲線。 一般而言，我們主要研究的是對數(shù)生長期的生長曲線。測定細胞生長曲線的方法1.細胞計數(shù)法（簡單、最常用、有誤差） （1）傳代后把細胞重懸

2、，得到細胞懸液，把懸液均勻加到24孔板中 （2）24 h后開始進行細胞計數(shù)，以后每隔24 h計數(shù)一次，每次取4孔細胞，分別進行計數(shù)，計數(shù)結(jié)果取4孔的平均值。連續(xù)計數(shù)6天。 （3）根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，以單位細胞數(shù)(細胞數(shù)/mL)為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線。 24孔板 細胞計數(shù)板2.MTT法（復(fù)雜，誤差小）原理MTT：全稱為3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide漢語化學(xué)名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽商品名：噻唑藍，是一種黃顏色的染料。 活細胞的線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠使外源性的

3、MTT還原，同時在細胞色素C 的作用下，生成不溶于水的藍色（或藍紫色）絡(luò)合物甲臜。 按照時間間隔，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm（或570nm）波長處測定甲臜 的光吸收值（A值）。 在通常情況下，甲臜生成量與活細胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光吸收值推算出活細胞的數(shù)目。 由于死細胞中不含琥珀酸脫氫酶，因此加入 MTT 不會有反應(yīng)。 1.標準曲線的測定: 例如：用培養(yǎng)液將待檢細胞重懸，得到細胞懸液，按照4x104/ml細胞密度梯度 ,分別接種于 96孔板 ,每孔 100l,重復(fù) 3孔;采用 MTT法測量吸光值A(chǔ)值,同一濃度下測得的A值為該濃度下3孔的平均值。 依檢測結(jié)果 ,得到吸光值 A值與細胞濃度的對

4、應(yīng)關(guān)系，繪出標準曲線。2.細胞生長曲線的測定: 例如：用培養(yǎng)液將待檢細胞制成 1104/ml的細胞懸液;分別接種于多塊96孔板 ,每孔 100l ;在 24、 48、 72、 96及 120 h時間點取一塊 96孔板 ,采用 MTT法測量吸光值A(chǔ)值得到吸光值A(chǔ)值與時間的關(guān)系。 根據(jù)標準曲線計算出相應(yīng)的細胞數(shù) ,再繪出細胞的生長曲線。 2.細胞生長曲線擬合及細胞群體倍增時間的簡化計算曲線擬合曲線擬合（curve fitting）是指選擇適當?shù)那€類型來擬合觀測數(shù)據(jù)，并用擬合的曲線方程分析兩變量間的關(guān)系。SPSSSPSS是世界上最早的統(tǒng)計分析軟件，由美國斯坦福大學(xué)的三位研究生Norman H. N

5、ie、C. Hadlai (Tex) Hull 和 Dale H. Bent于1968年研開發(fā)成功，同時成立了SPSS公司，并于1975年成立法人組織、在芝加哥組建了SPSS總部。1984年SPSS總部首先推出了世界上第一個統(tǒng)計分析軟件微機版本SPSS/PC+，開創(chuàng)了SPSS微機系列產(chǎn)品的開發(fā)方向，極大地擴充了它的應(yīng)用范圍，并使其能很快地應(yīng)用于自然科學(xué)、技術(shù)科學(xué)、社會科學(xué)的各個領(lǐng)域。 通常地，細胞生長曲線的函數(shù)擬合模型是但由于細胞增值是二次分裂生長，所以選用 作為細胞生長曲線的擬合模型更為合適。又因為在SPSS中的曲線擬合功能選項中并沒有 的 函數(shù)擬合模型，只有于是我們可以通過變換從而能使用SPSS中的函數(shù)擬合模型進行曲線擬合。原始數(shù)據(jù)曲線1. 培養(yǎng)天數(shù) X ln2曲線2.進入對數(shù)生長期天數(shù) X ln2依據(jù)以上變量進行曲線擬合,記錄相應(yīng)的a,b值。2.2 細胞群體倍增時間的簡化計算方法細胞群體倍增時間的計算方法有2種。1.做圖法:在細胞生長曲線的對數(shù)生長期找出細胞增加一倍所需的時間,即倍增時間,2.公式法,按細胞倍增時間計算細胞群體倍培時間,其為公式為：（Nt為對數(shù)生長期任一點的理論觀察值,N0為