快速篩選一抗二抗原則課件

1、一抗、二抗的選擇5、常用抗體供應(yīng)商篩選4、二抗的選擇3、一抗的選擇1、抗原基礎(chǔ)知識(shí)概述2、抗體基礎(chǔ)知識(shí)概述抗原基礎(chǔ)知識(shí)概述抗原基礎(chǔ)知識(shí)概述 抗原(antigen)：是指一種能刺激人或動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反 應(yīng)的物質(zhì)。打個(gè)比方：抗原一般是侵入機(jī)體的病原微生物或者機(jī)體病變的、非正常的成分，是侵略者?？乖A(chǔ)知識(shí)概述抗原包括免疫原性和反應(yīng)原性。免疫原性又稱(chēng)為抗原性，是指能夠刺激機(jī)體形成特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。反應(yīng)原性是指能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)?？乖幕拘再|(zhì)具有異物性、大分子性和特異性?？贵w是機(jī)體免疫細(xì)胞被抗原激活后

2、，由分化成熟的終末B細(xì)胞識(shí)別抗原后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，主要存在于血清等體液中，能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。打個(gè)比方：抗體是對(duì)付抗原的防御力量。因?yàn)橛星致哉叩娜肭?，才有抵抗侵略者的防御力量。免疫球蛋白（Ig），可分為分泌型（sIg）和膜結(jié)合型（mIg）兩類(lèi)， 抗體都是免疫球蛋白（Ig），并非所有免疫球蛋白都具有抗體活性。抗體基礎(chǔ)知識(shí)概述抗體的結(jié)構(gòu) Ig 分子的基本結(jié)構(gòu)是由四肽鏈組成的。即：由二條相同的分子量較小的肽鏈(輕鏈) 和二條相同的分子量較大的肽鏈(重鏈) 組成。 輕鏈與重鏈?zhǔn)怯啥蜴I連接形成一個(gè)四肽鏈分子稱(chēng)為 Ig 分子的單體；單體是構(gòu)成所有免疫球蛋

3、白分子的基本結(jié)構(gòu)；所有抗體 的單體都是四條肽鏈的對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，即：兩條糖基化重鏈(H) 和兩條非糖基化輕鏈(L) ；每條重鏈和輕鏈分為氨基端(N 端) 和羧基端(C 端) 。抗體基礎(chǔ)知識(shí)概述依據(jù)免疫球蛋白的重鏈，可分為 5 類(lèi)， 、 、 、 、 鏈，五類(lèi)免疫球蛋白分別稱(chēng)為： IgM， IgG， IgA， IgD 和 IgE?？贵w基礎(chǔ)知識(shí)概述 不同抗原表位刺激所產(chǎn)生不同的抗體分子，其識(shí)別抗原的特異性不同（V區(qū)不同）同一抗原表位誘生的不同類(lèi)型的抗體，其識(shí)別抗原的特異性相同（C區(qū)不同）免疫球蛋白有不同種類(lèi)免疫球蛋白同時(shí)可作為抗原，其具有不同的抗原特異性，因此免疫球蛋白具有異質(zhì)性?？贵w基礎(chǔ)知識(shí)概述一抗的選

4、擇一抗的選擇1、分析試驗(yàn)應(yīng)用的類(lèi)型 一般抗體說(shuō)明書(shū)都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)適用于何種分析類(lèi)型，如：可以應(yīng)用于 WBIHCICCELASA分析等，如果抗體說(shuō)明書(shū)沒(méi)有提及的應(yīng)用類(lèi)型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類(lèi)型，而僅是說(shuō)明尚未經(jīng)過(guò)此種分析試驗(yàn)驗(yàn)證，如果抗體不適用某些分析試驗(yàn)，則會(huì)在抗體說(shuō)明書(shū)上標(biāo)注出來(lái)不適于某分析試驗(yàn)。一抗的選擇2、樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì) 了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇最合適的抗體，至少需要從以下幾方面進(jìn)行考慮： 待測(cè)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來(lái)，其中的免疫原包括：全長(zhǎng)蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機(jī)體（如：細(xì)菌）或細(xì)胞，抗體說(shuō)明書(shū)一般都有免疫原

5、的描述，如果打算檢測(cè)的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長(zhǎng)的某一區(qū)域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。 如果打算用FACS流式檢測(cè)活細(xì)胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來(lái)免疫制備的抗體。一抗的選擇4、一抗宿主的種類(lèi)選擇 一般說(shuō)來(lái)，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無(wú)偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿主動(dòng)物的物種選擇較為重要，對(duì)于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)。例如：檢測(cè)小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測(cè)分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。一抗的選擇5、抗體的標(biāo)記和檢測(cè) 抗體的

6、標(biāo)記檢測(cè)可分為直接法和間接法兩大類(lèi)。直接法是將抗體經(jīng)過(guò)純化，再用一種易于識(shí)別的示蹤劑標(biāo)記，然后使其直接與抗原結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)抗體上的標(biāo)記物來(lái)測(cè)定相應(yīng)抗原。在間接法中，抗體既不用標(biāo)記也無(wú)須純化，當(dāng)其與抗原結(jié)合后經(jīng)過(guò)洗滌除去未結(jié)合的抗體，再通過(guò)二級(jí)試劑如標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體或蛋白A、蛋白G等來(lái)檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物。 檢測(cè)方法直接法間接法標(biāo)記位置標(biāo)記一抗標(biāo)記二抗優(yōu)點(diǎn)檢測(cè)步驟較少，背景低敏感性高，標(biāo)記物應(yīng)用范圍廣、一抗無(wú)需標(biāo)記，較易掌握缺點(diǎn)敏感性偏低，每一種抗體均需分別標(biāo)記較難掌握背景較高一抗的選擇5、直接法和間接法的選用 當(dāng)使用標(biāo)記二抗時(shí)，無(wú)須自己制備標(biāo)記反應(yīng)試劑，可從許多廠商購(gòu)買(mǎi)。有關(guān)試劑可大批量制

7、備并經(jīng)過(guò)檢定，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。通常情況下，推薦使用間接法和商品化試劑。但有時(shí)，必須使用直接標(biāo)記的抗體。最常見(jiàn)的情況是共定位研究，即需要在同一細(xì)胞或組織標(biāo)本中定位分析兩種或多種抗原。在這種情況下，每一抗體都需經(jīng)過(guò)純化并標(biāo)記不同的示蹤物，以便對(duì)相應(yīng)抗原的位置做出對(duì)比。此外，當(dāng)背景因素影響結(jié)果時(shí)，使用標(biāo)記的一抗是行之有效的方法。 二抗的選擇二抗的選擇 二抗廣義上是指專(zhuān)門(mén)和一抗進(jìn)行特異性反應(yīng)和結(jié)合的抗體，即抗體的抗體，其主要作用是檢測(cè)抗體的存在，放大一抗的信號(hào)。 利用抗原-抗體反應(yīng)原理，就是以一抗作為探針，它與目的蛋白作用并連接，再用帶有熒光（或同位素）標(biāo)記的二抗與一抗作用，最后顯色，發(fā)光位置就有目的蛋白。二抗的選擇二抗的選擇 常見(jiàn)的抗體供應(yīng)商抗體篩選Abcam中搜索GAPDH界面截圖 由圖，可發(fā)現(xiàn)有不止一種針對(duì)于GAPD