基因工程-5章 目的基因的制備課件

1、第五章 目的基因的制備一、目的基因的概念二、獲得目的基因的方法三、目的基因用途2022/10/171一、目的基因的概念外源基因:插入到載體上并導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)的特定基因或DNA片段，稱為外源基因。目的基因：通常將那些已被或者準(zhǔn)備要被分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的特定基因或DNA片段，稱為目的基因。2022/10/172目的基因主要是編碼蛋白質(zhì)(酶)的結(jié)構(gòu)基因，諸如抗逆性相關(guān)基因、生物藥和保健品相關(guān)基因、毒物降解相關(guān)基因以及工業(yè)用酶相關(guān)基因等。隨著生物長(zhǎng)期的進(jìn)化，生物界積累了大量對(duì)人類有用的基因。它是大自然恩賜于人類的寶貴資源，等待人們?nèi)ラ_(kāi)發(fā)利用。2022/10/173二、獲得目的基因的方法直接分離法

2、逆轉(zhuǎn)錄法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR法)鳥(niǎo)槍法人工化學(xué)合成法基因文庫(kù)法(基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù))mRNA差異顯示法2022/10/174鳥(niǎo)槍法 鳥(niǎo)槍法：是將基因組全部打亂,切成碎片,進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序,測(cè)序后再將它們拼接起來(lái)，進(jìn)而獲得目的基因的方法。鳥(niǎo)槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離。2022/10/175鳥(niǎo)槍法制備目的基因的主要步驟染色體DNA的切斷超聲波處理：片段長(zhǎng)度均一，大小可控，平頭末端全酶切： 片段長(zhǎng)度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開(kāi)，大小不可控部分酶切： 片段長(zhǎng)度可控，含有粘性末端，目的基因完整DNA片段與載體連接如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選

3、擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇表達(dá)型載體2022/10/177重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞篩選含有目的基因的目的重組子菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法（篩選模型的建立）2022/10/178對(duì)已知定位的目的基因，只要根據(jù)目的基因兩側(cè)的已知的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，用適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶切割，一次就可獲得目的基因。即使含目的基因的DNA分子未定序或無(wú)定位，也只須先通過(guò)酶切分析，隨后再通過(guò)部分酶切，克隆構(gòu)建一個(gè)非常

4、簡(jiǎn)單的基因組文庫(kù)，從中釣出目的基因。 2022/10/1710基因分離的物理化學(xué)法這是基因工程在發(fā)展初期所用的方法，某些生物的rDNA基因最早都是利用該法分離獲得的?；驹硎荄NA分子的兩條鏈存在著GC、A=T堿基配對(duì),其中GC間存在3個(gè)氫鍵，AT間存在2個(gè)氫鍵。不同基因片段的堿基組成差異較大，其理化性質(zhì)，如浮力密度和解鏈溫度等也有明顯不同，采用適當(dāng)方法可從基因組分離出目的基因。物理化學(xué)法分離目的基因的方法主要有密度梯度離心法、單鏈酶解法和分子雜交法等。 2022/10/1711基因的化學(xué)合成化學(xué)合成DNA的實(shí)質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個(gè)個(gè)接上去，每接一個(gè)單體就是一個(gè)循環(huán)反應(yīng)，包括：

5、基團(tuán)保護(hù)、分離、縮合、分離、去保護(hù)五大操作單元。2022/10/17122022/10/1715補(bǔ)釘延長(zhǎng)法：根據(jù)目的基因兩條互補(bǔ)鏈全序列，分別合成12-15堿基長(zhǎng)的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長(zhǎng)的單鏈DNA中片段2022/10/1717大片段酶促法：根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長(zhǎng)的單鏈DNA片段。2022/10/17182022/10/1719DNA化學(xué)合成的用途合成天然基因：如生長(zhǎng)激素釋放抑制素基因、胰島素基因、干擾素基因等合成探針合成引物合成連接子和接頭修飾改造基因：如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等設(shè)計(jì)新型基因2022/10/1720逆轉(zhuǎn)錄法酶促逆轉(zhuǎn)錄主要用

6、于合成分子質(zhì)量較大，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA易分離的目的基因。這種方法以目的基因的mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成互補(bǔ)的DNA，即cDNA，然后在DNA聚合酶的催化下合成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)?shù)妮d體重組后轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增，獲得目的基因的cDNA克隆。2022/10/1721cDNA第一鏈的合成2022/10/1722cDNA第二鏈的合成引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的5端序列2022/10/1724PCR法擴(kuò)增目的基因 2022/10/1725應(yīng)用某種基因大量表達(dá)，生產(chǎn)所需要的蛋白質(zhì)或多肽（如胰島素、干擾素等藥物）。在農(nóng)、林、牧、副、漁業(yè)中，改造某些目的基因，以改良品種，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。建立基因療法，選用某種正常基因，引入患者體內(nèi)，對(duì)某些先天性遺傳疾病進(jìn)行治療。