凝膠過(guò)濾層析法教學(xué)專用課件

1、凝膠過(guò)濾層析法凝膠過(guò)濾層析（分子篩層析、排阻層析）10/17/20221凝膠過(guò)濾層析法凝膠過(guò)濾層析（分子篩層析、排阻層析）10/一、凝膠過(guò)濾介質(zhì)凝膠過(guò)濾(gel filtration)是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小進(jìn)行分離的一種方法。凝膠過(guò)濾的優(yōu)點(diǎn)：1、介質(zhì)為不帶電的惰性物質(zhì)，不與溶質(zhì)分子作用，分離條件溫和，收率高，重現(xiàn)性好2、工作范圍廣，分離分子量的覆蓋面大3、設(shè)備簡(jiǎn)單，易于操作，周期短，可連續(xù)使用。10/17/20222一、凝膠過(guò)濾介質(zhì)凝膠過(guò)濾(gel filtration)是利凝膠過(guò)濾介質(zhì)應(yīng)具備的條件1、介質(zhì)本身為惰性物質(zhì)，在應(yīng)用過(guò)程中它不與溶質(zhì)、溶劑分子發(fā)生任何作用2、應(yīng)盡

2、量減少介質(zhì)內(nèi)含的帶電離子基團(tuán)，以減少非特異吸附性，提高蛋白質(zhì)的收率3、介質(zhì)內(nèi)孔徑大小要分布均勻4、凝膠珠粒大小均勻5、介質(zhì)要具有優(yōu)良的物理化學(xué)穩(wěn)定性及較高的機(jī)械強(qiáng)度，易于消毒，延長(zhǎng)了介質(zhì)的使用壽命10/17/20223凝膠過(guò)濾介質(zhì)應(yīng)具備的條件1、介質(zhì)本身為惰性物質(zhì)，在應(yīng)用過(guò)程中常見(jiàn)的凝膠種類1、多糖類骨架的介質(zhì)：以天然多糖為母體的凝膠過(guò)濾介質(zhì)，這類介質(zhì)具有親水性及與生物大分子的相容性，可允許生物大分子透過(guò)而不發(fā)生變性。這類介質(zhì)的缺點(diǎn)是多為軟基質(zhì)，壓力降大時(shí)不易操作。因此在經(jīng)典的多糖類介質(zhì)的基礎(chǔ)上又生產(chǎn)出剛性、半剛性的骨架和瓊脂糖與葡聚糖接枝而成的復(fù)合凝膠(超膠Superdex)高效介質(zhì)。10/

3、17/20224常見(jiàn)的凝膠種類1、多糖類骨架的介質(zhì)：以天然多糖為母體的凝膠過(guò)凝膠過(guò)濾介質(zhì)的種類2、合成大分子骨架的介質(zhì)：選用高親水性單體，經(jīng)共聚反應(yīng)而合成的多孔結(jié)構(gòu)過(guò)濾介質(zhì)。主要產(chǎn)品有聚丙烯酰胺類、聚乙烯醇系及羥甲基酰胺類。3、天然大分子與合成高聚物構(gòu)成混合骨架的介質(zhì)10/17/20225凝膠過(guò)濾介質(zhì)的種類2、合成大分子骨架的介質(zhì)：選用高親水性單體主要凝膠過(guò)濾介質(zhì)的牌號(hào)及骨架結(jié)構(gòu)10/17/20226主要凝膠過(guò)濾介質(zhì)的牌號(hào)及骨架結(jié)構(gòu)10/15/20226主要的凝膠過(guò)濾 介質(zhì)(一)、葡聚糖系1、葡聚糖系Sephadex結(jié)構(gòu)：以氯代環(huán)氧丙烷為交聯(lián)劑的葡聚糖珠狀凝膠，依據(jù)孔徑不同形成G型凝膠系列產(chǎn)品

4、，G后數(shù)字表示凝膠的吸水量，是其吸水量的10倍。G也表示凝膠交聯(lián)度的大小，G越小，交聯(lián)度越大，孔徑越小，排阻的分子越小。10/17/20227主要的凝膠過(guò)濾 介質(zhì)(一)、葡聚糖系1、葡聚糖系Sepha10/17/2022810/15/202282、性能：(1)溶脹性 Sephadex系均以干態(tài)供應(yīng)，使用前必須在過(guò)量的溶劑中充分溶脹后才能使用。(2)化學(xué)穩(wěn)定性 Sephadex不溶于一切溶劑，在水、鹽溶液、有機(jī)溶劑、堿及弱酸溶劑中均較穩(wěn)定。因葡聚糖中的糖苷鍵在強(qiáng)酸中可發(fā)生降解作用，所以只能接觸強(qiáng)酸的稀溶液，在0.1mol/L鹽酸中可接觸12小時(shí)，在0.02mol/L鹽酸中經(jīng)6個(gè)月均無(wú)明顯變化，但

5、要避免作用氧化劑。10/17/202292、性能：(1)溶脹性 Sephadex系均以干態(tài)供應(yīng)，使(3)物理穩(wěn)定性 pH中性濕態(tài)珠體可經(jīng)受120、30min高壓滅菌而不影響色譜性能(4)機(jī)械強(qiáng)度 Sephadex凝膠的機(jī)械強(qiáng)度取決于交聯(lián)度，交聯(lián)度越大，機(jī)械強(qiáng)度越高。機(jī)械強(qiáng)度與柱床所能承受的壓力有關(guān)，其壓力與流速的關(guān)系為：V=KP LV：線速度， cm/h； P：壓力降，cm水柱；L：床高；K：比滲透率，受粒徑影響較大。10/17/202210(3)物理穩(wěn)定性 pH中性濕態(tài)珠體可經(jīng)受120、30mi葡聚糖凝膠(G)型號(hào)分離范圍(分子量)吸水量(克克干凝膠)膨脹體積(毫升克干凝膠)浸泡時(shí)間蛋白質(zhì)多

6、糖202590100 10700700 1.02-33115150015001.52.5-3.531251000-5000100-50002.54-631501500-30000500-100005.09-1131753000-700001000-500007.512-152431004000-1500001000-1000001015-207251505000-4000001000-1500001520-307252005000-8000001000-2000002030-4072510/17/202211葡聚糖凝膠(G)型分離范圍(分子量)吸水量(克克干凝膠)膨Sephadex的型號(hào)及性能

7、10/17/202212Sephadex的型號(hào)及性能10/15/2022123、主要用途：孔徑較小的凝膠主要用于脫鹽、肽與其他小分子的分離；孔徑較大的凝膠用于蛋白質(zhì)與其他大分子的分離。DNA級(jí)的Sephadex適用于DNA或低聚核苷酸的分離。4、衍生系：在經(jīng)典葡聚糖凝膠的基礎(chǔ)上，引入特殊基團(tuán)后生成葡聚糖凝膠的衍生系，主要有LH系，如以G25為母體引入羥丙基成LH20，以G50為母體引入羥丙基成為L(zhǎng)H60。特點(diǎn)是LH系除具有凝膠過(guò)濾的作用外，同時(shí)具有分配層析及吸附層析的作用。10/17/2022133、主要用途：孔徑較小的凝膠主要用于脫鹽、肽與其他小分子的分Sephadex經(jīng)改性后比其母體具有更

8、廣泛的用途，適用于脂類、甾類、脂肪酸、激素、維生素及其他小分子的分級(jí)分離。LH系列主要用途：用于有機(jī)溶劑中的凝膠過(guò)濾，尤其適用于嗜脂性分子及制備各種天然產(chǎn)物； 結(jié)合凝膠過(guò)濾、分配層析及吸附層析的特點(diǎn)，能分離結(jié)構(gòu)非常相近的分子及其他凝膠難以處理的樣品； 排阻極性與原母體凝膠相同。LH20對(duì)芳香多環(huán)化合物的分離比LH60好而LH60更適用于分配層析。 對(duì)樣品的負(fù)載量大，負(fù)載量可高達(dá)300mg/ml凝膠。10/17/202214Sephadex經(jīng)改性后比其母體具有更廣泛的用途，適用于脂類(二)、瓊脂糖系 由經(jīng)過(guò)純化的瓊脂糖制備，其中含有極小的帶電基團(tuán)。利用瓊脂糖熱溶液冷卻時(shí)可凝膠化的特點(diǎn)，能方便地制

9、成珠狀物。在凝膠過(guò)程中由單獨(dú)的多糖鏈先形成雙螺旋，然后聚集成膠束。膠束之間有孔，孔的大小取決于膠束的多少即瓊脂糖的濃度。傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠非特異性吸附極低，分離范圍很廣，分離范圍從1000040000000，所以適用于分子量差距較大的分子間分離，分辨率不很高。瓊脂糖凝膠有兩種牌號(hào)BioGel A系和Sepharose10/17/202215(二)、瓊脂糖系 由經(jīng)過(guò)純化的瓊脂糖制備，其中含有極小的帶10/17/20221610/15/202216BioGel A系型號(hào)及性能10/17/202217BioGel A系型號(hào)及性能10/15/202217Sepharose系型號(hào)能性能10/17/2022

10、18Sepharose系型號(hào)能性能10/15/202218Sepharose是該系中最早的產(chǎn)品，為非交聯(lián)結(jié)構(gòu)，因此不能進(jìn)行高壓滅菌，僅能在240范圍內(nèi)使用。根據(jù)瓊脂糖含量的不同，對(duì)含量為2、4及6的產(chǎn)品分別命名為2B、4B和6B。由于新型凝膠的不斷出現(xiàn)，此型凝膠有逐漸被淘汰的趨勢(shì)。10/17/202219Sepharose是該系中最早的產(chǎn)品，為非交聯(lián)結(jié)構(gòu)，因此不能Sepharose CL是瓊脂糖珠體與2，3二溴丙醇反應(yīng)后具有共價(jià)交聯(lián)鍵的產(chǎn)物。交聯(lián)結(jié)構(gòu)大大提高了珠體的熱穩(wěn)定性及 物理化學(xué)穩(wěn)定性，但對(duì)孔結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。交聯(lián)后凝膠在還原條件下經(jīng)堿水解去除了硫酸根，減少了帶電基團(tuán)，使非特異吸附比其母體

11、小。凝膠在中性條件下可經(jīng)受120 消毒，處理后其色譜性能不變。特別適用于含有機(jī)溶劑的分離，流速比傳統(tǒng)的Sepharose有明顯提高并可廣泛用于離子交換劑及親和吸附劑的母體。10/17/202220Sepharose CL是瓊脂糖珠體與2，3二溴丙醇反應(yīng)后Superose由珠狀瓊脂糖經(jīng)過(guò)兩次交聯(lián)而制備的新型凝膠。用含雙環(huán)氧基及多環(huán)氧基的混合長(zhǎng)交聯(lián)劑對(duì)瓊脂糖珠體進(jìn)行第一階段交聯(lián)，然后再與含雙環(huán)氧基的短鏈交聯(lián)劑進(jìn)行第二次交聯(lián)。經(jīng)兩次交聯(lián)反應(yīng)后的珠體大大提高了介質(zhì)的剛性和增強(qiáng)了物理化學(xué)穩(wěn)定性。用0.1mol/L的HCl溶液及0.1mol/L的 NaOH在40處理兩周，色譜性能無(wú)明顯變化，還可經(jīng)受70甲

12、酸及30乙腈處理。10/17/202221Superose由珠狀瓊脂糖經(jīng)過(guò)兩次交聯(lián)而制備的新型凝膠。用Superose為剛性半剛性珠體，在高黏性液體如8mol/L尿素下也能保持適當(dāng)流速將廣泛的分離范圍及高分辨率集于一身，適用于糖類、核酸、病毒等的分離，特別是包含體蛋白在促溶劑中的純化。能一次性分離生物分子大小差異較大按的混合物。由于顆粒細(xì)小，粒度分布均勻，柱效高，可允許高流速，適用于中、高壓層析系統(tǒng)分離。10/17/202222Superose為剛性半剛性珠體，在高黏性液體如8mol/Sepharose Fast Flow 是新型的BioProcess凝膠介質(zhì)，經(jīng)過(guò)高度交聯(lián)的瓊脂糖珠體。具有機(jī)

13、械強(qiáng)度高、流速快、極高的物理化學(xué)穩(wěn)定性及非特異性吸附極低等特點(diǎn)，而適合工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)使用。對(duì)蛋白質(zhì)的回收率很高，并可用多種促溶劑及有機(jī)溶劑或12mol/L的NaOH進(jìn)行清洗。10/17/202223Sepharose Fast Flow (三)、聚丙烯酰胺系由丙烯酰胺與N,N亞甲基雙丙烯酰胺共聚而成的親水性凝膠。是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的合成高聚物，不受微生物侵蝕，可在120消毒30min后，色譜性能不變。干膠的羧基含量3.0mmol/g，含有極少的游離電荷，所以非特異性吸附很小。還可以通過(guò)改變交聯(lián)劑的用量控制凝膠孔徑的大小，得到不同排阻極限的系列產(chǎn)品。10/17/202224(三)、聚丙烯酰胺系由丙烯酰胺與

14、N,N亞甲基雙丙烯酰胺共10/17/20222510/15/202225BioGel P類凝膠10/17/202226BioGel P類凝膠10/15/202226(四)、Sephacryl系列由烯丙基葡聚糖與N,N亞甲基雙丙烯酰胺經(jīng)共聚而成的一種共價(jià)交聯(lián)的剛性珠體，有6種不同的分離范圍，具有廣闊的選擇性，具有良好的機(jī)械性能，可進(jìn)行快速的高分辨率的純化。其穩(wěn)定性能可用0.5mol/L的NaOH進(jìn)行清洗及再生。由于其化學(xué)穩(wěn)定性，使其既適用于水溶液，又可用于多種有機(jī)溶劑體系?？稍诳蒲屑肮I(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。10/17/202227(四)、Sephacryl系列由烯丙基葡聚糖與N,N亞甲10/17/202

15、22810/15/202228Sephacryl系列產(chǎn)品性能10/17/202229Sephacryl系列產(chǎn)品性能10/15/202229(五)、Superdex系列產(chǎn)品 是最新的凝膠過(guò)濾介質(zhì)，屬BioProcess介質(zhì)中的一種。是將葡聚糖以共價(jià)鍵方式結(jié)合到高交聯(lián)的多孔瓊脂糖珠體上形成的復(fù)合凝膠。是將交聯(lián)葡聚糖優(yōu)良的過(guò)濾選擇性及高交聯(lián)的瓊脂糖的物理化學(xué)穩(wěn)定性集于一身的具有優(yōu)良選擇性和高分辨率的產(chǎn)品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40處理400小時(shí)而分辨率保持不變。10/17/202230(五)、Superdex系列產(chǎn)品 是最新的凝膠過(guò)濾介質(zhì)，屬Superdex結(jié)構(gòu)10/

16、17/202231Superdex結(jié)構(gòu)10/15/202231Superdex(BioPrecess介質(zhì))素列產(chǎn)品性能10/17/202232Superdex(BioPrecess介質(zhì))素列產(chǎn)品性能10(六)、聚乙烯醇系(Toyopearl)：以交聯(lián)聚乙烯醇為骨架的凝膠過(guò)濾介質(zhì)，20世紀(jì)80年代初部世，由美國(guó)R&H公司與日本曹達(dá)公司聯(lián)合開(kāi)發(fā)。是多孔的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大分子鏈上含有豐富的羥基，使其具有高度親水性，進(jìn)行化學(xué)改性后可轉(zhuǎn)變?yōu)楹卸喾N功能基的離子交換劑及親和吸附劑。Fractogel TSK是該系列的類似產(chǎn)品，適用于HPLC(高效液相層析)。10/17/202233(六)、聚乙烯醇系(To

17、yopearl)：以交聯(lián)聚乙烯醇為骨Toyopearl系型號(hào)及性能10/17/202234Toyopearl系型號(hào)及性能10/15/202234二、分子篩原理10/17/202235二、分子篩原理10/15/20223510/17/20223610/15/20223610/17/20223710/15/202237凝膠層析中常用的術(shù)語(yǔ)和參數(shù)10/17/202238凝膠層析中常用的術(shù)語(yǔ)和參數(shù)10/15/202238床體積：膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積（Vt）表示。Vt=V0+Vi+Vg內(nèi)水體積：是層析基質(zhì)顆粒內(nèi)部所含水的體積，用（V0）表示。外水體積：層析基質(zhì)顆粒之間所含水的體積，用（Vi

18、）表示?；|(zhì)體積：層析基質(zhì)本身在層析柱中所占有的體積（Vg）表示。10/17/202239床體積：膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積（Vt）表示。Vt膨脹度：在一定溶液中，單位重量的基質(zhì)充分溶脹后所占有的體積，用Vg表示。即每克溶脹所具有的床體積。分配系數(shù)：指一組分在固定相與流動(dòng)相中含量的比值。10/17/202240膨脹度：在一定溶液中，單位重量的基質(zhì)充分溶脹后所占有的體積，凝膠過(guò)濾的分配常數(shù)Kav= Vt-VoVe-Vo在給定的條件下，Vt和Vo都為恒定值，而Ve隨著分離物分子質(zhì)量的變化而變化。對(duì)凝膠過(guò)濾，其分配常數(shù)應(yīng)在0Kav1。當(dāng)被分離物質(zhì)完全排阻時(shí)，Kav等于0，Ve等于V0；當(dāng)被分

19、離物質(zhì)自由擴(kuò)散時(shí)，Kav等于1，Ve等于VoVi。10/17/202241凝膠過(guò)濾的分配常數(shù)Kav= Vt-VoVe-Vo在給定的條從上式可以看出，Ve、Vo可通過(guò)層析過(guò)程中測(cè)定，只要測(cè)出Vt即可計(jì)算出Kav。Vt是凝膠過(guò)濾柱床總體積，由三部分組成，即VoViVg。 Vtr2h或用 VtVoViVgVg很小，可忽略不計(jì)。V0一般用藍(lán)色葡聚糖2000測(cè)定，其分子是為200萬(wàn)，呈藍(lán)色，在各種型號(hào)的葡聚糖凝膠中都被完全排阻，并可直接觀察。10/17/202242從上式可以看出，Ve、Vo可通過(guò)層析過(guò)程中測(cè)定，只要測(cè)出VtVi的測(cè)定：選用一種分子量小于凝膠工作范圍下限的化合物，測(cè)出洗脫體積，減去V0就

20、是Vi。常用鉻酸鉀來(lái)測(cè)定，鉻酸鉀為黃色化合物，可直接觀察，優(yōu)點(diǎn)為不與葡聚糖起任何反應(yīng)；也可用硫酸銨測(cè)定，用硝酸銀檢出洗脫峰。10/17/202243Vi的測(cè)定：選用一種分子量小于凝膠工作范圍下限的化合物，測(cè)出常用參數(shù)： 1/2h0.607h10/17/202244常用參數(shù)： 1/2h0.607h10/15/202244如圖所示為一色譜流出曲線：10/17/202245如圖所示為一色譜流出曲線：10/15/202245基線：在正常的操作條件下，僅有流動(dòng)相（無(wú)被分離樣品）通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的信號(hào)。層析峰：樣品從洗脫開(kāi)始到樣品流出層析柱時(shí)，檢測(cè)器對(duì)層析樣品和層析時(shí)間所產(chǎn)生的信號(hào)。峰高：峰的最大值到峰

21、底的距離。峰寬：層析峰半高峰時(shí)的寬。峰面積：峰與峰底間的面積。10/17/202246基線：在正常的操作條件下，僅有流動(dòng)相（無(wú)被分離樣品）通過(guò)檢測(cè)層析峰區(qū)域?qū)挾劝敕鍖挘悍甯咭话胩幍姆鍖挾取７鍖挘悍宓幕€寬度，通過(guò)層析峰兩側(cè)拐點(diǎn)作切線交于基線上的距離。標(biāo)準(zhǔn)差：樣品組分被帶出層析柱的分散度，用表示。兩側(cè)拐點(diǎn)之間的距離為2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。Wb=4 =1.699W1/2W1/2=2.354 10/17/202247層析峰區(qū)域?qū)挾劝敕鍖挘悍甯咭话胩幍姆鍖挾?。峰寬：峰的基線寬度保留值：表示樣品中各組分在層析柱中停留時(shí)間的長(zhǎng)短或組分流出時(shí)所需流動(dòng)相體積的大小。保留時(shí)間和保留體積：樣品組分通過(guò)層析柱出峰所需的時(shí)間稱

22、保留時(shí)間；樣品組分通過(guò)層析柱出峰時(shí)所需流動(dòng)相的體積稱保留體積。10/17/202248保留值：表示樣品中各組分在層析柱中停留時(shí)間的長(zhǎng)短或組分流出時(shí)死時(shí)間或死體積：柱中未被固定相所占有的空間，如柱的接口、柱出口管路、檢測(cè)器內(nèi)腔空間及柱內(nèi)填充空隙等稱為死體積；流動(dòng)相流經(jīng)死體積所需的時(shí)間稱死時(shí)間。調(diào)整保留時(shí)間或調(diào)整保留體積：保留時(shí)間中扣除死時(shí)間后的時(shí)間；或保留體積中扣除死體積后的體積。10/17/202249死時(shí)間或死體積：柱中未被固定相所占有的空間，如柱的接口、柱出分離度：指相鄰兩峰的保留時(shí)間差值是是兩峰寬平均值的幾倍。因Wb=4 ，即分離度為1時(shí)， tR 4 。兩峰有98分離。Rs tR2-tR

23、1(W1+W2) 2( tR2-tR1) W1+W2當(dāng)W1=W2，且峰面積相等時(shí) RstR/ W10/17/202250分離度：指相鄰兩峰的保留時(shí)間差值是是兩峰寬平均值的幾倍。因W柱效：層析過(guò)程是一個(gè)連續(xù)過(guò)程，流動(dòng)相不斷流過(guò)，在任何一點(diǎn)上實(shí)際上都無(wú)法獲得平衡，當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)柱的一定高度，在離開(kāi)這段柱時(shí)，流動(dòng)相中某組分的平均濃度與固定相中的平均濃度可以達(dá)到分配平衡，完成這一平衡所需要的柱長(zhǎng)稱為理論塔板等效高度，簡(jiǎn)稱板高N=L/H10/17/202251柱效：層析過(guò)程是一個(gè)連續(xù)過(guò)程，流動(dòng)相不斷流過(guò)，在任何一點(diǎn)上實(shí)10/17/20225210/15/202252凝及的選擇和處理凝膠的選擇1、凝膠的選擇

24、(1)型號(hào)的選擇：選擇時(shí)主要根據(jù)凝膠的篩分范圍、凝膠分辨率及分離目的而確定。(2)粒度的選擇：2、凝膠用量的計(jì)算：根據(jù)層析柱的體積和干凝膠的膨脹度按以下公式計(jì)算；干凝膠用量(g)r2h 膨脹度(床體積/g)10/17/202253凝及的選擇和處理凝膠的選擇1、凝膠的選擇(1)型號(hào)的選擇：選10/17/20225410/15/20225410/17/20225510/15/20225510/17/20225610/15/2022563、凝膠的處理：將所用的干凝膠慢慢傾入510倍的蒸餾水中，按凝膠本身的要求進(jìn)行溶脹時(shí)間進(jìn)行浸泡，棄去上層懸浮的小顆粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LN

25、aCl溶液在室溫下浸泡0.5h抽濾除去堿液，用蒸餾水洗至中性。注：為除去凝膠中的氣泡，可把處理過(guò)的凝膠浸泡于蒸餾水或平衡液中以抽真空的方式實(shí)現(xiàn)。也可采用加熱煮沸的方法，這種方法可在除氣泡的同時(shí)加快溶脹速度。但不能在酸或堿液中加熱。10/17/2022573、凝膠的處理：將所用的干凝膠慢慢傾入510倍的蒸餾水中，三、層析柱1、柱的選擇：與一般離子交換用的柱結(jié)構(gòu)相同。近來(lái)多用多孔的聚乙烯片做底板，也可用尼龍濾布制成擋板。活脫液流出后的空間為死體積，層析的死體積越小越好。10/17/202258三、層析柱1、柱的選擇：與一般離子交換用的柱結(jié)構(gòu)相同。近來(lái)多10/17/20225910/15/20225

26、9一般來(lái)說(shuō)，用同樣直徑的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時(shí)，長(zhǎng)層析柱比短的分辨率高；用同樣長(zhǎng)的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時(shí)，直徑大的比直徑小的柱分辨率高。凝膠過(guò)濾柱的徑高比(D/H)一般在1:251:100的范圍之間，也有特殊要求的凝膠過(guò)濾的柱徑高比更大。對(duì)凝膠過(guò)濾層析柱最好有夾套，這樣可以便于溫控。10/17/202260一般來(lái)說(shuō)，用同樣直徑的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時(shí)，長(zhǎng)層析柱比10/17/20226110/15/20226110/17/20226210/15/2022622、裝柱3、上柱、洗脫與收集樣品的上柱量與以下因素有關(guān)：樣品檢測(cè)的靈敏度凝膠介質(zhì)的性質(zhì)樣品的粘度分離的分辨率混合物中各成分的性質(zhì)

27、差異10/17/2022632、裝柱3、上柱、洗脫與收集樣品的上柱量與以下因素有關(guān)：樣品上樣量對(duì)層析結(jié)果有直接的關(guān)系，上柱體積比上柱濃度的影響更大。10/17/202264上樣量對(duì)層析結(jié)果有直接的關(guān)系，上柱體積比上柱濃度的影響更大。在凝膠過(guò)濾層析中，流速是重要的參數(shù)，流速與層析的分辨率有直接的關(guān)系I、層析柱：2.6cm85cm,流速2ml/cm2h-1II、層析柱：2.6cm85cm,流速25.5ml/cm2h-1III、層析柱：2.6cm19.5cm,流速24.5ml/cm2h-110/17/202265在凝膠過(guò)濾層析中，流速是重要的參數(shù)，流速與層析的分辨率有直接在凝膠過(guò)濾層析中，樣品的粘度

28、也是一個(gè)需要考慮的因素。一個(gè)粘度很大的樣品上柱后，樣品分子因運(yùn)動(dòng)受限制，進(jìn)出凝膠的孔隙不易，因此峰形顯得寬而矮，有些可以分離的組分也會(huì)因此而重迭。結(jié)果如圖：10/17/202266在凝膠過(guò)濾層析中，樣品的粘度也是一個(gè)需要考慮的因素。一個(gè)粘度血紅蛋白在凝膠過(guò)濾柱上的分離圖譜，層析柱：4cm85cm,Sephadex G-25;流速：180ml/cm2h-1未加葡聚糖2000，粘度：1.0厘泊10/17/202267血紅蛋白在凝膠過(guò)濾柱上的分離圖譜，層析柱：10/15/202血紅蛋白在凝膠過(guò)濾柱上的分離圖譜，層析柱：4cm85cm,Sephadex G-25;流速：180ml/cm2h-1加2.5%葡聚糖2000，粘度：4.2厘泊10/17/202268血紅蛋白在凝膠過(guò)濾柱上的分離圖譜，層析柱：10/15/202血紅蛋白在凝膠過(guò)濾柱上的分離圖譜，層析柱：4cm85cm,Sephadex G-25;流速：180ml/cm2h-1加5.0%葡聚糖2000，粘度：11.8厘泊10/17/202269血紅蛋白在凝膠過(guò)濾柱上的分離圖譜，層析柱：10/15/202在特殊情況下，為使層析形成很好的界而，希望樣品的比重大