質(zhì)粒圖譜的閱讀課件

1、第六章 基因克隆的技術(shù)路線1基因工程（上游）大體步驟獲取目的基因目的基因與載體連接連接產(chǎn)物導(dǎo)入細(xì)胞目的基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄PCR法PCR法直接調(diào)用法各種質(zhì)粒各種病毒皆經(jīng)改造原核細(xì)胞真核細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞2第一節(jié)獲得目的基因3直接分離目的DNA 經(jīng)限制酶切割，電泳分離DNA片斷。 適用于獲得細(xì)菌、質(zhì)粒、病毒等低等生物的基因片段。 真核生物的染色體DNA中含有內(nèi)含子序列，不適合于基因工程的需要。42. cDNA文庫(kù)The cDNA library :contains only complementary DNA molecules synthesized from mRNA molecules i

2、n a cell. 以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成的互補(bǔ)DNA。以此得到的某種細(xì)胞內(nèi)所有mRNA的cDNA，稱為cDNA文庫(kù)。5第二節(jié) 重組DNA分子的構(gòu)建7 Link of cohesive end粘末端連接一.目的基因與載體的連接8平末端連接Recombinant DNAT4 DNA ligasevector110平末端連接的缺點(diǎn)*more difficult ligation 連接困難*2-direction insertion 雙向插入*self-reconnection 自身環(huán)化*no easy way of retrieving the insert 重新篩選插入的片斷困難11vec

3、tor12vector12AABAB 平齊末端連接時(shí)，插入的方向是隨機(jī)的，稱為雙向插入。會(huì)給后續(xù)的工作造成很多麻煩。12單酶切粘末端連接的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)*Using the same one enzyme to cut 用同一種酶切 *Ligated easily and coveniently 連接容易方便缺點(diǎn)*Self-reconnection of vector 載體自身環(huán)化 *Inserted in two directions 雙向插入14單酶切粘末端的雙向插入GCTTAAAATTC GAATTC GGCTTAAGCTTAAAATTC GGCTTAAAATTC G15AATTCxxxxxx

4、A GxxxxxxTTCGAG AGCTTCTTAA AGAATTCxxxxxxAAGCTTCTTAAGxxxxxxTTCGAAligase雙酶切粘末端連接EcoRI HindIIIEcoRI HindIII17雙酶切粘末端連接的特點(diǎn)*Using the same two enzymes to cut*Ligated easily and conveniently*no self-reconnection of vector*Inserted in one direction 定向插入缺點(diǎn) 操作比較麻煩。如果兩種酶要求的條件不同，需要進(jìn)行兩個(gè)階段的反應(yīng)。18幾種實(shí)驗(yàn)方法利用相應(yīng)的技術(shù)方法，使實(shí)

5、驗(yàn)順利進(jìn)行。19Link of homopolymeric tails 添加同聚尾避免質(zhì)粒的自身環(huán)化末端轉(zhuǎn)移酶20添加接頭，引入限制酶的切割位點(diǎn)，然后用相應(yīng)的酶切割。21野生型細(xì)菌具有針對(duì)外源DNA的限制和修飾系統(tǒng)，會(huì)切割外源DNA分子。因此用于基因工程的受體菌，需經(jīng)篩選和人工改造。第三節(jié) 重組子導(dǎo)入細(xì)胞22The first is a chemical method utilizing CaCl2 and heat shock to promote DNA entry into cells. 氯化鈣法 ：利用氯化鈣和熱休克使受體菌成為感受態(tài)細(xì)胞，促進(jìn)外源 DNA的進(jìn)入。 24 宿主細(xì)胞與重組

6、DNA在00C的氯化鈣溶液中孵育，快速轉(zhuǎn)入420C造成熱休克。經(jīng)此處理后的細(xì)胞“容易”接受外源的DNA，一般叫做感受態(tài)細(xì)胞。25 處于感受態(tài)的細(xì)菌表面正電荷增加，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)有改變， 通透性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)化子易于進(jìn)入細(xì)胞。27其他處理受體細(xì)胞的方法利用二甲基亞砜（DMSO）處理細(xì)胞二巰基蘇糖醇（DTT）處理細(xì)胞。利用聚乙二醇（PEG）處理細(xì)胞。28When competent cells are mixed with DNA， some cells (actually, very few) become transformed: they acquire recombinant vector DNA

7、.Pseudo-positivepositive29 第四節(jié) 重組子的篩選與鑒定30After transformation，only a few cells take up the plasmid DNA，and there only has one recombinant molecule in one recipient cell(受體細(xì)胞)，so a method is needed for selecting those 轉(zhuǎn)化步驟后，轉(zhuǎn)進(jìn)重組質(zhì)粒的細(xì)胞是較少的。因此需要挑選出含有重組子的細(xì)胞。31Direct selection 直接篩選Antibotic resistance 抗菌

8、素抗性Marker rescue selection 借助顏色篩選In situ hybridization 原位雜交Immunology selection 免疫篩選Immunochemistry method 免疫化學(xué)Enzyme immunodetection assay 酶免疫分析32 質(zhì)粒載體帶有氨芐青霉素抗性基因，在宿主細(xì)胞內(nèi)該抗性基因表達(dá)出可水解氨芐青霉素的酶，因而宿主細(xì)胞可在含氨芐青霉素的瓊脂糖平板上生長(zhǎng)。利用抗生素抗性篩選33復(fù)制起點(diǎn)氨芐青霉素抗性基因3435362.利用顏色篩選 插入失活現(xiàn)象X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷37多克隆位點(diǎn)半乳糖苷酶的基

9、因內(nèi)有多克隆位點(diǎn)，酶切插入外源DNA后，該基因無(wú)法表達(dá).3839 完整的LacZ基因內(nèi)，經(jīng)過(guò)改造加入了多克隆位點(diǎn)，但并不影響LacZ基因的表達(dá)。 當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，完整的LacZ基因表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)菌的有關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物共同組成有功能的半乳糖苷酶，該酶把無(wú)色的X-gal切割成半乳糖和藍(lán)色的5溴4氯靛藍(lán)，使得菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。40表示外源基因插入編碼半乳糖苷酶的基因區(qū)段41Target gene4243藍(lán)色菌落無(wú)插入序列白色菌落含插入序列轉(zhuǎn)化菌具有氨芐青霉素抗性，可在 加有氨芐青霉素的平板上生長(zhǎng)。44使用含Amp+X-Gal的瓊脂糖平板篩選克隆，可能出現(xiàn)三種情況。1 . 載體自身環(huán)化，產(chǎn)生藍(lán)色菌落；2 帶

10、有正確插入目的基因序列的菌落，白色菌落。3 未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，不能生長(zhǎng)。4546Blue colonies represent Ampicillin-resistant bacteria that contain pVector and express a functional alpha fragment from an intact LacZ alpha coding sequence.White colonies represent Ampicillin-resistant bacteria that contain pInsert and do not produce LacZ alpha

11、 fragment.47483. In situ hybridization 原位雜交 生長(zhǎng)在瓊脂糖平板上的菌落，可定點(diǎn)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，加入放射性的探針（即帶有 放射性的與目的片斷互補(bǔ)的核酸片斷），與菌落雜交。經(jīng)洗滌后的膜與X光膠片作用，挑選出陽(yáng)性克隆。4950DNA hybridization 5152535455免疫法篩選外源基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出的蛋白質(zhì)，可與特異性的抗體結(jié)合。56利用抗體篩選原理 目的基因編碼的蛋白質(zhì)作為抗原，用特異性抗體與之反應(yīng)，再根據(jù)顏色等變化，篩選出菌落。方法 在瓊脂平板上的菌落，轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜上，若某菌落帶有目的基因，并可表達(dá)該目的基因所編碼的蛋白質(zhì)，則加入該

12、蛋白質(zhì)的特異抗體，可與該菌落結(jié)合，附著在濾膜上，不會(huì)被洗掉。該抗體可攜帶酶或熒光，易于檢測(cè)。57Screening with antibodies is used when cloned gene is expressed and antibodies recognizing the encoded protein are available. 58第五節(jié) 基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定59基因表達(dá)基因表達(dá)指某基因在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄為mRNA繼而翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程。DNARNAProtein轉(zhuǎn)錄翻譯60研究基因表達(dá)的手段1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western

13、 blot (蛋白質(zhì)） 4、免疫組化 （蛋白質(zhì)）611、RT-PCR基本原理：將細(xì)胞中mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。根據(jù)PCR產(chǎn)物的量，判斷基因表達(dá)的強(qiáng)度。mRNAcDNAPCR產(chǎn)物622、Northern blot標(biāo)記探針與膜固相RNA雜交。根據(jù)雜交信號(hào)強(qiáng)弱判斷表達(dá)量，根據(jù)雜交信號(hào)位置判斷分子長(zhǎng)度。雜交信號(hào)63實(shí)驗(yàn)操作：1）RNA提取2）RNA電泳（分離不同長(zhǎng)度RNA)3）轉(zhuǎn)膜 (形成固相RNA)4）探針標(biāo)記（同位素/非同位素）5）雜交6）洗膜7）顯影（放射性/酶促反應(yīng)）64Northern blot 特點(diǎn)：因?yàn)闆](méi)有擴(kuò)增過(guò)程，Northern blot 的結(jié)果可靠性高。可以確定未知基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）長(zhǎng)度。優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：1、操作煩瑣2、使用同位素可能污染環(huán)境3、靈敏度低4、對(duì)RNA質(zhì)量要求高653、Western blot標(biāo)記抗體與固定在膜上